實驗四--蛋白質純化---鹽析沉淀法

1、實驗四 蛋白質純化 鹽析沉淀法【實驗目的】采用硫酸銨鹽析法將日本血吸蟲谷胱甘肽硫轉移酶融合蛋白從大腸桿菌BL21（DE3）pGEX-NS53細胞裂解液中分離出來，使學生學習掌握制備細胞裂解液的技術和采用鹽析法從中分離目的蛋白質的技術?！緦嶒炘怼坑名}析法從成分復雜的蛋白質溶液（如細胞裂解液）中提取目的蛋白質是一種傳統(tǒng)的目前仍被廣泛使用的蛋白質分離純化技術。此種技術的工作原理如下：蛋白質在稀鹽溶液中，其溶解度會隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱作鹽溶。但是當鹽的濃度繼續(xù)增高時，蛋白質的溶解度又以不同程度地下降并先后從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象 是由于蛋白質分子中極性基團之間存在靜電

2、力。在低鹽濃度下，蛋白質分子中極性基團之間的靜電力受鹽離子的影響而被消除，蛋白質在水中的極性基團的電荷被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質分子之間相互聚集并從溶液中析出。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。 鹽析的一般操作步驟是，選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0-25%飽和度的硫酸銨）使部分雜質呈“鹽析”狀態(tài)從溶液中沉淀出來，經(jīng)離心法去除。而目的蛋白質呈鹽溶狀態(tài)，存在于上清中。增加鹽濃度（如25-60%飽和度的NH4SO4）使目的蛋白質呈鹽析狀態(tài)，而從溶液中分離出來。在鹽析時，蛋白質的溶解度與溶液中離子強度的關系，可用下式表示： Slg = -Ks&

3、#215;I S0式中的S為蛋白質在離子強度為I的溶解度，S0蛋白質在純水（離強度為0）中的溶解度；KS為鹽析常數(shù)。離子強度I可用下式表示：I=1/2Z2式中，M-溶液中各種離子克分子濃度 Z-各種離子所帶的電荷數(shù)在溫度恒定時，S0對于某一種蛋白質在某一溶液中的溶解度是一個常數(shù)，lgS0也為一常數(shù)，以代替，故式（1）可以改寫為：lgS=b-Ks×I （3）值主要與蛋白質的結構，鹽離子的平均半徑以及鹽離子的電荷數(shù)有關，也受溶液中的氫離子濃度（PH值）和溫度影響。一般來說，蛋白質在某一鹽溶液中的鹽析系數(shù)-KS越大，鹽析效果越好。由于蛋白質含有許多親水基團，需要在較高的I植下才能從溶液中析

4、出。由式（3）可以看出，在一定的溫度和PH值下，改變鹽的離子強度（I）可以把不同的蛋白質從溶液中沉淀出來。此種方法稱為“KS分段鹽析法”,常用于蛋白質的初步提純。在一定的的I值下，改變溫度及PH值，使蛋白質從溶液中沉淀出來，稱為“分段鹽析法”，常用蛋白質純化過程的后期，特別是某些蛋白質結晶析出時。蛋白質鹽析常用硫酸銨等中性鹽。硫酸銨因其溶解度大（25時的飽和硫酸銨溶液的摩爾濃度為4.1M，即767克/升，0時為3.9M，676克/升），溫度系數(shù)小而被廣泛使用。硫酸銨價格便宜，不易引起蛋白質變性并具有穩(wěn)定蛋白質的作用，分段效果比其他鹽類好，廢液可以作肥料，對環(huán)境無污染。其缺點是，其NH+4對用凱

5、氏定氮測定蛋白質含量有干擾，硫酸銨溶液的PH常在4.5-5.5之間,其緩沖能力比較差。有時用硫酸鈉.。蛋白質鹽析時,鹽的濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時，溶液飽和度調度方法有三種，一是當?shù)鞍踪|溶液體積不大，需調正的濃度不高時，可以向蛋白質溶液中添加飽和鹽溶液。另一種方法是向蛋白質溶液中直接添加磨碎的鹽結晶粉末，此種方法用于需要的鹽濃度高，而且蛋白質溶液體積不宜過分增加時。第三種方法是將待鹽析蛋白質的溶液裝于透析裝內對飽和硫酸銨進行透析，此法鹽濃度變化比較連續(xù)平穩(wěn)，不會出現(xiàn)局部過高現(xiàn)象。但是鹽析時需要測定鹽的飽和度，過程復雜，較少應用。采用方法一時，所需添加的飽

6、和鹽溶液的體積可按下式計算： S2-S1V=V0 1-S2式中，V飽和鹽溶液的體積 V0原溶液的體積 S1原溶液的飽和度 S2要達到的飽和度采用第二種方法時，可從附表一中選擇要達到某一濃度時所需添加的固體硫酸銨量。影響蛋白質鹽析的因素：（1）蛋白質溶液中鹽的濃度。不同蛋白質的鹽析要求鹽的飽和度不同。從成分復雜的蛋白質溶液中分離蛋白質時，鹽的飽和度應由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白質沉淀就應將其分離除去后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質沉淀出來；（2）蛋白質溶液的PH值。在蛋白質的等電點時，蛋白質的溶解度最小而容易沉淀出來，因此鹽析時應將PH值調節(jié)在目的蛋白質的等電點附近；（3）蛋白質濃度

7、。在相同鹽析條件下，蛋白質濃度越大越易被鹽析沉淀。但是濃度太高時，易使雜蛋白共沉淀；（4）溫度。濃鹽溶液對蛋白質有一定的保護作用，因此一般的鹽析操作可以在室溫下進行。【實驗器材】 100ml燒杯，50ml離心管，高速冷凍離心機,微量離心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝膠電泳儀一臺,1ml,200l,20l移液器各1把,1ml,200l和20l槍各1支,微量離心管支架,磁力攪拌器及攪拌磁棒?！緦嶒灢牧稀?大腸桿菌BL21（DE3）pGEXNS53細胞裂解液，由上一實驗提供2分析純硫酸銨：用干凈的磁研缽研成細粉末。330%三氯乙酸4SDS-PAGE所需試劑【實驗方法】1 鹽析曲線的測定對于一求

8、知鹽析特性的蛋白質來說，用鹽析作為一純化步驟時，應首先用實驗確定使此種蛋白質鹽析沉淀出來的最佳飽和度，其測定方法如下： （1）取7支微量離心管，用記號筆在管帽上標記20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述離心管作容器分別稱取磨細的硫酸銨晶體末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；（3）分別向上述裝有（NH4）2SO4粉末的離心管中添加0.5ml細胞裂解液，充分振蕩使（NH4）2SO4溶解后，在室溫下靜置2小時；（4）將離心管放置于離心機中，以1000轉/分轉速離心5分鐘后，傾去上清，倒立離心管，以便盡可能多地

9、去除上清；（5）添加0.5ml蒸餾水及8l30%三氯乙酸混勻,靜置10分鐘后,離心,盡量去除上清；(因此步會造成蛋白質不溶影響后續(xù)工作，所以省略)（6）將離心管置于快速干燥器中干燥30分鐘；（7）向離心管中添加100ISDS-PAGE上樣緩沖液懸浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分鐘，取出置-20冰箱中備用；（8）制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠；按下列上樣順序向加樣孔中添加10l 樣品：樣孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10包涵體樣20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 包涵體 空白對照電泳分離后，染色、脫色、觀察目的蛋白質出現(xiàn)在何種濃度的（NH4）2SO4鹽析樣孔中，以確定最佳的鹽析條件。2鹽析（1）將50ml細胞裂解液置于100ml燒杯中，加入攪拌磁棒后放置在磁力攪拌器上（2）在攪拌狀態(tài)下緩緩加入研細的（NH4）2SO4末至最佳飽和度之前的一級飽和度，靜置2小時后,離心得上清（3）在攪拌下向上清中添加研細的（NH4）2SO4粉末，使終濃度達最佳飽和度，靜置2小時后離心收集目的蛋白沉淀（4）將沉淀的蛋白質溶解于盡量小體積的磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，用Bradford試劑測定蛋白質濃度后，