實(shí)驗(yàn)四+PCR及電泳技術(shù)ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)4 PCR及電泳技術(shù)及電泳技術(shù)1. PCR1. PCR的基本原理的基本原理PCR基本原理基本原理 類似于類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。在模板的體內(nèi)復(fù)制。在模板DNA、引物和、引物和4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸存在條件下依賴于存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR的基本步聚的基本步聚 1、變性、變性 (Denaturation) ：通過加熱使：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈形成單鏈DNA 。 2、退火、退火 (Annealing) ：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，反應(yīng)體系中引物和其互補(bǔ)的：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，反應(yīng)體系中引物和其互補(bǔ)

2、的DNA模板在局部形成雜交鏈。模板在局部形成雜交鏈。 3、延伸、延伸 (Extension )：在：在DNA聚合酶和聚合酶和4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及及Mg2+存在條件下，存在條件下，53的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。鏈延伸反應(yīng)。 這種熱變性這種熱變性-復(fù)性復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)，PCR就是在合適就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (

3、95)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意圖原理示意圖 模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使左右一定時(shí)間后，使模板模板DNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；5335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGG

4、ATCG加熱加熱94引物酶 模板模板DNA與引物的退火與引物的退火(復(fù)性復(fù)性)：模板：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至溫度降至55左右，引物與模板左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533引物酶3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATC

5、GCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3553PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物結(jié)合物在引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，以以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與

6、半保留復(fù)制原為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板理，合成一條新的與模板DNA 鏈。鏈。3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5533引物引物End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence 每完成一個(gè)循環(huán)需每完成

7、一個(gè)循環(huán)需2-4 min， 2-3 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。大幾百萬倍。3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5533Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle

8、 = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconPCR儀PCR儀PCR儀模板模板引物引物Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶4 4種種dNTPdNTP混合物混合物Mg2+Mg2+1010緩沖液緩沖液 引物是引物是PCRPCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；特異性反應(yīng)的關(guān)鍵； PCRPCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板脫氧核糖核酸互補(bǔ)的程度；產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板脫氧核糖核酸互補(bǔ)的程度； 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)

9、離子交換人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)離子交換HPLCHPLC進(jìn)行純化。進(jìn)行純化。510PCR緩沖液緩沖液 (Mg2+)： 500 mM KCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明膠。明膠。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系： 10PCR buffer 2.5l dNTP mix 各各0.5l 引物引物1 0.5 l 引物引物2 0.5 l DNA模板模板 2 l Taq 酶酶 0.5 l 加雙蒸水至總體積為加雙蒸水至總體積為25lPCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增程序: 94, 300S 94, 60S 55, 60S 72, 60S 72, 7min

10、30 循環(huán)2. 電泳技術(shù)電泳技術(shù)電泳槽電泳槽制膠板制膠板梳子梳子電源電源電泳儀電泳儀提供穩(wěn)定的電壓或電流提供穩(wěn)定的電壓或電流電極緩沖液和凝膠的容器電極緩沖液和凝膠的容器形成點(diǎn)樣孔形成點(diǎn)樣孔制備垂直或水平凝膠制備垂直或水平凝膠電泳分離的原理電泳分離的原理 電泳電泳(electrophoresis)(electrophoresis)溶液中帶電粒子溶液中帶電粒子( (離子離子) )在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。 1 1、電荷效應(yīng)、電荷效應(yīng) 利用帶電粒子在電場中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的目的。利用帶電粒子在電場中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的目的。 2 2、分子篩效應(yīng)、分子篩效應(yīng) 不同的分離介質(zhì)形成

11、的孔徑不同，在孔徑大的介質(zhì)中泳動(dòng)速度快，相反則慢。不同的分離介質(zhì)形成的孔徑不同，在孔徑大的介質(zhì)中泳動(dòng)速度快，相反則慢。 3 3、待分離生物大分子的性質(zhì)、待分離生物大分子的性質(zhì) 一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。遷移速度越快。 4 4、電場強(qiáng)度、電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度V/cmV/cm是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強(qiáng)度越大，電是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強(qiáng)度越大，電泳速度越快。泳速度越快。電泳技術(shù)的種類電泳技術(shù)的種類 按支持介質(zhì)的不同可分為：按支持介質(zhì)的不同可分為： 紙電泳

12、紙電泳(Paper electrophorisis) 醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳(Cellulose Acetate electrophoresis) 瓊脂凝膠電泳瓊脂凝膠電泳(Agar Gel electrophoresis) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳對(duì)于雙鏈對(duì)于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)分子大小有關(guān) 。1、熔化瓊脂糖時(shí)，宜低火，防暴沸；2、倒膠時(shí)溫度要低于60且速度要慢；3、拔梳子和點(diǎn)樣要小心，以免破壞膠孔；4、電泳儀打開前應(yīng)檢查電壓、電流旋紐是否處于零位置，工作電壓一般為60-80V，400mA，電泳完畢應(yīng)將電壓