五氯酚鈉急性染毒對(duì)小鼠免疫細(xì)胞損傷影響

1、五氯酚鈉急性染毒對(duì)小鼠免疫細(xì)胞損傷影響                 【摘要】 目的 觀察五氯酚鈉對(duì)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞功能的毒性作用。方法 將五氯酚鈉以25，50和100 mg/kg經(jīng)灌胃方式一次給予小鼠，然后觀察給藥后3，24和48 h小鼠各項(xiàng)免疫功能的變化，采用T淋巴細(xì)胞增殖法測(cè)定細(xì)胞免疫功能，采用B淋巴細(xì)胞增殖法測(cè)定體液免疫功能，采用巨噬細(xì)胞吞噬能力和分泌NO的能力來(lái)測(cè)定巨噬細(xì)胞功能。結(jié)果 100 mg/kg五氯酚

2、鈉染毒后3 h，小鼠的脾臟和胸腺相對(duì)重量較對(duì)照組降低，脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖能力受到抑制，腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和NO生成能力受到抑制。25和50 mg/kg五氯酚鈉在染毒后24 h依然對(duì)脾細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生抑制作用。這種抑制效應(yīng)到48 h時(shí)完全消失。結(jié)論 五氯酚鈉一次染毒在25100 mg/kg劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生抑制作用，100 mg/kg對(duì)巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制作用，對(duì)細(xì)胞免疫功能未見(jiàn)影響。 【關(guān)鍵詞】 五氯酚鈉五氯酚鈉(又稱滅釘螺藥，PCP-Na)是在世界范圍被廣泛使用的一種農(nóng)藥，由于大面積推廣，引起了一定的環(huán)境污染，對(duì)人類健康造成影響1，2。Lang等3利

3、用人淋巴細(xì)胞在體外接觸五氯酚研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論工業(yè)品還是分析純五氯酚在1040mol/L濃度下與淋巴細(xì)胞共同孵育8d，對(duì)于IgG和IgM抗體的產(chǎn)生量均有明顯的抑制作用。Daniel等4在人群研究中發(fā)現(xiàn)，血液中五氯酚濃度的升高能夠?qū)е耇細(xì)胞功能障礙。體外研究表明，5mg/L以上的五氯酚能夠抑制克鯉魚(yú)和港灣魚(yú)的巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞殺菌活性5。目前的研究基本上以五氯酚為主，盡管五氯酚鈉與五氯酚的代謝途徑類似，但其毒性表現(xiàn)是否一致仍需要進(jìn)一步探索。本研究采用五氯酚鈉一次性染毒小鼠，觀察染毒后不同時(shí)間提 （，。）小鼠免疫功能的變化。1 材料與方法11 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)ICR雌性小鼠150只(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部

4、實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)科學(xué)部)；體重2024g，雌性，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2002-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫，2025，動(dòng)物進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，自由飲用自來(lái)水。12 主要試劑 五氯酚鈉(國(guó)產(chǎn)，分析純，sodium pentachlorophenate)；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)，刀豆蛋白A(ConA)，脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)；RPMI1640完全培養(yǎng)液，Hanks液等。13 動(dòng)物染毒和處理 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。分別為對(duì)照組(蒸餾水)，25，50和100mg/kg組。將五氯酚鈉一次性以灌胃方式染毒，分別在小鼠染毒后3，24和48h，處死小鼠，取出臟器，剔除結(jié)締組織和脂肪，吸凈殘留

5、血液，稱重，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。14 T淋巴細(xì)胞增殖 處死小鼠，無(wú)菌取脾，制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×106個(gè)/ml。將每份細(xì)胞懸液分2孔加入24孔板，每孔1ml，其中一孔作為對(duì)照，另一孔加入20l ConA(400g/ml)做為刺激孔，將細(xì)胞放入5%CO2，37培養(yǎng)箱中孵育68h，取出加入MTT(5mg/kg)50l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打均勻，在酶標(biāo)儀上570nm波長(zhǎng)下比色。15 淋巴細(xì)胞增殖 方法同T淋巴細(xì)胞增值，所用刺激物為25l LPS(400g/ml)。16 巨噬細(xì)胞吞噬功能 處死小鼠后將RPMI 1640完全培養(yǎng)液2ml，注

6、入小鼠腹腔，收集灌洗的液體，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至×個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100l。將巨噬細(xì)胞置入5%CO2，37培養(yǎng)箱中孵育2h，取出后棄上清，加入用RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋的中性紅(50g/ml)100l，再置于5%CO2，37培養(yǎng)箱中孵育30min，取出96孔板，棄上清，每孔加入150l沖洗液，沖洗后棄去。再加入100l溶解液，在721分光光度計(jì)上540nm波長(zhǎng)下比色。17 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO測(cè)定 巨細(xì)胞收集同巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定，收集細(xì)胞后，將細(xì)胞調(diào)整至×個(gè)/ml，加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，放入5%CO2，37培養(yǎng)箱中孵育2h，取出后棄上清，每孔

7、重新加入1ml RPMI 1640完全培養(yǎng)液，同時(shí)加入LPS(終濃度5g/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，用1ml培養(yǎng)上清與1ml Greiss試劑混勻，于540nm波長(zhǎng)下比色。同時(shí)用亞硝酸鈉配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)上清中亞硝酸鹽氮含量。18 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。2 結(jié)果21 一般狀況211 不同劑量的五氯酚鈉一次染毒3 h對(duì)小鼠器官變化的影響(表1) 一次染毒3 h后，100 mg/kg五氯酚鈉劑量組小鼠的脾臟和胸腺相對(duì)重量明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝臟和腎臟相對(duì)重量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50和25 mg/kg五氯酚鈉劑量組小鼠脾臟、

8、胸腺、腎臟和肝臟的相對(duì)重量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1 不同劑量組染毒3 h后小 ( 五氯酚鈉急性染毒對(duì)小鼠免疫細(xì)胞損傷影響(2) 鼠器官重量變化（略）注：相對(duì)重=臟器濕重(mg)/體重(g)；與對(duì)照組比較*P005；n=5212 不同劑量染毒24h后小鼠器官變化25，50和100mg/kg五氯酚鈉一次給予小鼠24h后，小鼠的脾臟、胸腺、肝臟和腎臟的相對(duì)重要與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。22 五氯酚鈉毒對(duì)小鼠免疫功能的影響221 五氯酚鈉對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響 25，50和100mg/kg五氯酚鈉染毒小鼠3，24和48h后，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力均未受到影響。222 五氯酚鈉

9、對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞增殖的影響(表2) 25mg/kg劑量組染毒3h后，小鼠B淋巴細(xì)胞增殖能力受到抑制，抑制率為46%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，染毒后24和48h時(shí)這種抑制效應(yīng)消失。50mg/kg劑量組染毒3h，也可見(jiàn)小鼠B淋巴細(xì)胞增殖能力受到抑制，抑制率為46%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，至染毒后24h，這種抑制效應(yīng)依然存在，抑制程度減弱，抑制率為35%，進(jìn)一步觀察染毒后48h這種抑制效應(yīng)消失。100mg/kg劑量組染毒3和24h，小鼠B淋巴細(xì)胞的增殖能力均受到抑制，抑制率分別為38%和40%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)到染毒后48h，抑制效應(yīng)消失。表2 不同染毒劑量對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）注：與對(duì)照組比較*P005，

10、*P001；n=5223 五氯酚對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(表3) 本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量五氯酚鈉染毒組在3，24和48h時(shí)間點(diǎn)，只有100mg/kg組染毒3h后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能受到抑制，而其他時(shí)間點(diǎn)和劑量均未見(jiàn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞功能受到抑制。224 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響(表4) 由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在染毒所用的3個(gè)劑量中，只有100mg/kg五氯酚鈉在給藥3h后抑制了巨噬細(xì)胞分泌NO的能力，使得培養(yǎng)液中亞硝酸鹽氮含量減少，其他時(shí)間點(diǎn)和劑量均未觀察到巨噬細(xì)胞生成NO的能力受損。表3 五氯酚鈉對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（略）注：與對(duì)照組比較，* P001；n=5表4 五氯酚鈉對(duì)小

11、鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO的影響（略）注：與對(duì)照組比較，* P005；n=53 討論1000mg/kg五氯酚鈉一次給小鼠3h后，脾臟和胸腺重量明顯降低，小鼠的B淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞吞噬及巨噬細(xì)胞分泌NO均受到抑制，表明五氯酚鈉對(duì)免疫系統(tǒng)有抑制作用。而T淋巴細(xì)胞增殖未受影響，提示五氯酚鈉對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有害作用時(shí)，有一定的選擇性。五氯酚鈉給藥3h后，巨噬細(xì)胞100mg/kg組出現(xiàn)功能抑制，而脾臟B淋巴細(xì)胞增殖有25和50mg/kg就出現(xiàn)抑制，表明B淋巴細(xì)胞對(duì)五氯酚鈉毒性敏感。五氯酚在哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素P450微料體混合功能氧化酶參與代謝，轉(zhuǎn)化形成四氯氫醌(TCHQ)和四氯兒茶酚()6-8。四氯氫醌對(duì)免

12、疫細(xì)胞有損傷作用，但是五氯酚在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成四氯氫醌需要一定的時(shí)間。五氯酚(PC)在肝組織中經(jīng)過(guò)代謝，產(chǎn)生的未結(jié)合四氯氫醌于攝入PCP后4h達(dá)到高峰，其后下降排出，則達(dá)到臟器(脾臟，腹腔)的時(shí)間必然還要延遲。給予B6C3F雄性小鼠300mg/(kg·d)的四氯氫醌2周后肝細(xì)胞核DNA的8OHdG比對(duì)照組明顯增多，但是一次注射20或者50mg/kg的四氯氫在6和24h均未發(fā)現(xiàn)8OHdG的含量增加9，提示四氯氫醌在體內(nèi)的作用需較長(zhǎng)時(shí)間。因此，在本研究中，染毒3h后觀察到的免疫細(xì)胞功能的變化，可能是五氯酚鈉本身的直接作用。?1 Seiler JP.PentacholorophenalJ.Mut

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