甲腫消制劑及其含藥血清中哈巴俄苷的含量測(cè)定

1、甲腫消制劑及其含藥血清中哈巴俄苷的含量測(cè)定                  作者：張秋燕，崔翰明，劉喜明，朱曉蕓，白鴿  【摘要】   目的建立甲腫消制劑及灌胃給予甲腫消后大鼠血清中的哈巴俄苷含量測(cè)定方法。方法采用RP-HPLC法測(cè)定哈巴俄苷的含量，色譜柱：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m）和Easyguard保護(hù)柱，以乙腈和1醋酸溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫；流

2、速：1 ml? min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；進(jìn)樣量：5 l。結(jié)果哈巴俄苷在1.46146 g?ml-1的濃度范圍內(nèi)線性良好；低、中、高濃度哈巴俄苷的精密度（RSD）(n=5)分別為1.05%，0.59%，0.80%；日間差（RSD）（n=5）為1.00%；制劑和大鼠血清中哈巴俄苷的加樣回收率（n=5）分別為（98.02±1.01）%和（101.03±1.64）%；測(cè)定其重現(xiàn)性（RSD）（n=6）分別為0.73%和0.96%；每克制劑中含哈巴俄苷的量為230.5 g，每毫升含藥血清中哈巴俄苷的量為1.88 g。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好，可用于制劑和血清中

3、哈巴俄苷的含量測(cè)定。 【關(guān)鍵詞】   哈巴俄苷； 甲腫消制劑； 固相萃?。?反相高效液相色譜     ChinaAbstract：ObjectiveTo develop a determination method of Harpagoside in Jia Zhong Xiao preparation and blood serum of rat. Methods  The RP-HPLC method was applied as with: Kromasil C18 column（250 mm×4.6 mm，5 m）

4、and Easyguard column. The mobile phase was acetonitrile and 1% acetic acid with linearity gradient elution, the flow rate at 1 ml?min-1, and detection wavelength was 278nm. ResultsAn excellent linearity was obtained over the range of 1.46146 g?ml-1. The RSDs of accuracy for 7.3, 29.2, 146g?ml-1 were

5、 1.05%,0.59%,0.80%, respectively (n=5). The RSDs of intra-day validation were 1.00%. The mean recovery rates of Harpagoside in preparation and serum were (98.02±1.01)%, (101.03±1.64)%,respectively. The RSDs of the determination method for preparation and serum repeatability were 0.73% and

6、0.96%, respectively. The content of Harpagoside in preparation and serum was 230.5g?g-1 and 1.88g?ml-1, respectively.ConclusionThe method is simple, rapid, reliable and repeatable. Its quite suitable for the analysis of Harpagoside in Jia Zhong Xiao preparation and of rat serum.Key words：Harpagoside

7、;  Jia Zhong Xiao preparation;  SPE;  RP-HPLC    甲腫消處方由玄參、夏枯草等組成，按適當(dāng)工藝制備成濃度為3g?ml-1飲片的浸膏劑。動(dòng)物和臨床試驗(yàn)證明本制劑具有較好的化痰散結(jié)、 治療 甲亢型甲狀腺腫大的作用。處方中玄參具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，用于熱病傷陰、津傷便秘、目赤、咽痛等癥1，其含量較高的特征性成分為哈巴俄苷，有抗慢性炎癥、降壓、鎮(zhèn)痛、解痙、抗乙型肝炎病毒和免疫促進(jìn)等作用2，3。因此，我們采用反相高效液相色譜法建立了浸膏和大鼠血清中的哈巴俄苷的含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步闡明本方治

8、療甲亢的機(jī)理和控制制劑質(zhì)量提供分析方法。 1  儀器與材料 1.1  儀器Knaver 液相色譜儀、Knaver UV Detecter（德國(guó)Knaver公司）；Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；Easyguard保護(hù)柱（迪馬公司）；ME215P型 電子 天平；WH-90A微型旋渦混合機(jī)；TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī)；B600B型醫(yī)用低速離心機(jī)；固相萃取小柱（C18，200 mg，60 m，3 ml，瓦里安公司）。1.2  藥品和試劑哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)為200501）購(gòu)自 中國(guó) 藥檢所；藥材購(gòu)自同仁堂藥店；乙腈為色譜

9、純，冰醋酸為分析純，水為高純水。 2  方法與結(jié)果 2.1  色譜條件色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），以乙腈和1醋酸溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，比例見表1；流速：1 ml? min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm；進(jìn)樣量：5 l。色譜圖結(jié)果見圖1。表1  乙腈：1冰醋酸流動(dòng)相梯度表（略）2.2  甲腫消制劑和大鼠含藥血清的制備甲腫消制劑的制備：將玄參、夏枯草等飲片按適當(dāng)?shù)谋壤渲?，加水煎煮提取，提取液過(guò)濾，濃縮得濃度為生藥3 g?ml-1的浸膏劑。大鼠含藥血清的制備：選取體質(zhì)量（330±20）g的雄

10、性Wistar大鼠30只，其中20只按生藥15 g?kg-1的劑量灌胃給予甲腫消浸膏劑，10只按體質(zhì)量給予同容積生理鹽水，2次/d，連續(xù)7 d，末次灌胃后1 h，用玻璃毛細(xì)管自乙醚麻醉大鼠眼底采血，收集血樣于離心管中，放置2 h促凝，1 500 r?min-1離心10 min，吸取上清液，0.22 m濾膜過(guò)濾，濾液即為含藥血清和空白血清，-20冷凍保存。2.3  甲腫消樣品的前處理方法精密稱取甲腫消浸膏約2 g，用30甲醇（25，20，20 ml）超聲提取3次，提取時(shí)間分別為30，20，20 min，提取液離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 500 r?min-1，3次上清液合并，濃縮至微干

11、，再用30甲醇溶解并定容至25 ml，0.45 m濾膜過(guò)濾，濾液按“2.1色譜條件”項(xiàng)進(jìn)行含量測(cè)定。2.4  含藥血清中哈巴俄苷的前處理方法將C18SPE柱先用2 ml甲醇沖洗，再用2 ml水沖洗活化待用；精密移取解凍后的含藥血清2 ml，上樣于處理好的SPE柱中，先用4 ml水沖洗，再用2 ml甲醇洗脫，洗脫液過(guò)濾，濾液按“2.1色譜條件”項(xiàng)進(jìn)行含量測(cè)定。 2.5  標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定取適量哈巴俄苷對(duì)照品，置于樣品瓶中，在五氧化二磷干燥器中干燥12 h后，精密稱定3.65 mg，用30甲醇配制成濃度為146 g?ml-1的標(biāo)液，然后用30甲醇稀釋成濃度分別為2.92，7.3，

12、14.6，29.2，73 g?ml-1的標(biāo)液，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，以濃度C為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.218 1 C0.096 2， r2=1，哈巴俄苷在2.92146 g?ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。    取濃度為146 g?ml-1的哈巴俄苷標(biāo)液適量，用空白血清分別稀釋到200 l，渦漩混勻，使其濃度依次為1.46，3.65，7.3，14.6，29.2，73 g?ml-1，離心，上清液按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，以濃度C為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.186 3C0.051 5，r2

13、=0.999 4,血清樣品中哈巴俄苷在1.4673 g?ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.6  精密度和穩(wěn)定性的測(cè)定選濃度為7.3，29.2，146 g?ml-1的哈巴俄苷對(duì)照溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖，將峰面積代入線性方程中，求出 計(jì)算 濃度，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果見表2。表2  哈巴俄苷標(biāo)液的精密度和回收率（略）選濃度為29.2 g?ml-1的哈巴俄苷對(duì)照溶液，連續(xù)5 d進(jìn)樣，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算其日間差（RSD）為1.00%。    選濃度為3.65，14.6，73 g

14、?ml-1的哈巴俄苷血清對(duì)照溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖，將峰面積代入線性方程中，求出計(jì)算濃度，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）,結(jié)果見表3。表3  哈巴俄苷血清標(biāo)液的精密度和回收率（略）選濃度為14.6 g?ml-1的哈巴俄苷血清對(duì)照溶液，連續(xù)5天進(jìn)樣，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算其日間差（RSD）為0.63%（n=5）。2.7  加樣回收率的測(cè)定精密稱取已知含量的甲腫消制劑5份，再精密加入已知濃度的哈巴俄苷對(duì)照溶液，分別按“2.3”項(xiàng)和“2.1”項(xiàng)操作，測(cè)定其含量，將峰面積代入線性方程計(jì)算哈巴俄苷的濃度，計(jì)算平均回收率為（9

15、8.02±1.01）%，并求精密度RSD為1.03%。    精密量取空白血清5份，再精密加入已知濃度的哈巴俄苷對(duì)照溶液，分別按“2.4”項(xiàng)和“2.1”項(xiàng)操作，測(cè)定其含量，將峰面積代入線性方程計(jì)算濃度，計(jì)算平均回收率為（101.03±1.64）%，并求精密度RSD為1.63%。2.8  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱定甲腫消浸膏6份，稱量量分別為2.047 2，2.028 8，2.043 1，2.027 4，2.057 0，2.044 g，按照“2.3”項(xiàng)中供試品溶液的制備方法制備6份樣品，分別取5 l進(jìn)樣，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖。

16、根據(jù)峰面積計(jì)算哈巴俄苷的含量，并求得6次測(cè)定的RSD為0.73%。    精密移取含藥血清2 ml，按“2.4”項(xiàng)中含藥血清供試液的制備方法制備6份樣品，分別取5 l進(jìn)樣，按“2.1色譜條件”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積計(jì)算哈巴俄苷的含量，并求得6次測(cè)定的RSD為0.96%。2.9  甲腫消制劑和大鼠血清中哈巴俄苷的測(cè)定精密稱定甲腫消浸膏2.037 5 g，按“2.3”和“2.1”項(xiàng)操作，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積和線性方程計(jì)算，每克制劑中含哈巴俄苷的量為230.5 g；精密移取含藥血清2 ml,按“2.4”和“2.1”項(xiàng)操作，記錄含藥血清中哈巴俄苷的峰面

17、積，根據(jù)峰面積和其線性方程計(jì)算，每毫升含藥血清中哈巴俄苷的量為1.88 g。 3  討論     實(shí)驗(yàn)中采用 中國(guó) 藥典2005版玄參項(xiàng)下的色譜分析方法，但在測(cè)定浸膏樣品時(shí)，20 min左右有一個(gè)較大的峰出現(xiàn)，若此時(shí)停止樣品的測(cè)定，即進(jìn)下個(gè)樣品時(shí)，會(huì)影響后續(xù)測(cè)定，所以將時(shí)間延長(zhǎng)到25 min；在測(cè)定完一個(gè)樣品時(shí)，需要將流動(dòng)相調(diào)至初始比例，運(yùn)行4 min左右，等柱壓穩(wěn)定在初始水平時(shí)，即可進(jìn)樣，否則哈巴俄苷色譜峰的保留時(shí)間容易受影響；測(cè)定樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)室溫在17以上時(shí)，哈巴俄苷色譜峰的分離度R1.5，當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，哈巴俄苷色譜峰受干擾峰影響，分離度R1.5，因此，室溫應(yīng)維持在17以上。    有 文獻(xiàn) 3報(bào)道玄參中哈巴俄苷的提取溶劑采用30%甲醇提取效果較好，因此本實(shí)驗(yàn)在考察甲腫消樣品的預(yù)處理方法時(shí)，重點(diǎn)考察了提取時(shí)間、溶劑用量和提取次數(shù)，結(jié)果顯示當(dāng)提取時(shí)間為30 min、提取3次時(shí)，能較完全地提取哈巴俄苷成分，因此試驗(yàn)采用提取3次，每次提取時(shí)間分別為30，20，20 min進(jìn)行樣品制備。    由于大鼠血清中哈巴俄苷含量