實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

1、實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)分離血清蛋白質(zhì)n掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理n學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)n了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)系統(tǒng)（即緩聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)系統(tǒng)（即緩沖液成分、沖液成分、pHpH及凝膠孔徑不連續(xù)）聚丙烯酰胺及凝膠孔徑不連續(xù)）聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過凝膠電泳，通過濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、電荷效濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)應(yīng)，將血

2、清中各蛋白質(zhì)成份依其分子大小、電荷，將血清中各蛋白質(zhì)成份依其分子大小、電荷多少不同而進行高效分離。多少不同而進行高效分離。 實驗原理實驗原理 由單體聚丙烯酰胺由單體聚丙烯酰胺(Acr)(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。 Bis Bis：交聯(lián)劑：交聯(lián)劑 過硫酸銨過硫酸銨(AP) (AP) ：引發(fā)劑，提供自由基，：引發(fā)劑，提供自由基， 引發(fā)聚合反應(yīng)引發(fā)聚合反應(yīng) 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)：催化劑：催化劑, , 加快引發(fā)加快引發(fā) 釋放自由基的速度釋放自由基的速度n 聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺

3、凝膠（PAGPAG）的聚合反應(yīng)：）的聚合反應(yīng)： 1. 1. 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) n 分離機制：分離機制：凝膠層孔徑不連續(xù)：濃縮膠大孔徑，分離膠小孔徑凝膠層孔徑不連續(xù)：濃縮膠大孔徑，分離膠小孔徑pH值不連續(xù)：電泳緩沖液值不連續(xù)：電泳緩沖液pH=8.3；濃縮膠；濃縮膠pH=6.7； 分離膠分離膠pH=8.9緩沖液離子不連續(xù)：電泳液中緩沖液離子不連續(xù)：電泳液中Gly-(慢離子慢離子)；凝膠中；凝膠中 Cl-(快離子快離子)；Pr-介于二者之間介于二者之間電位梯度不連續(xù)電位梯度不連續(xù)成分成分pH值值孔徑孔徑電泳緩沖液電泳緩沖液甘氨酸甘氨酸(慢離子慢離子)8.3樣品樣品蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)6.7濃縮膠濃縮膠Cl-

4、(快離子快離子)6.7大大分離膠分離膠Cl-(快離子快離子)8.9小小有效遷移率有效遷移率 = 遷移率遷移率 解離度解離度 電泳時，氯離子跑得電泳時，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮質(zhì)夾在中間而被壓縮2. 2.分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率的遷移率3. 3

5、.電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 電荷量不同，遷移率不同。電荷量不同，遷移率不同。實驗儀器及試劑實驗儀器及試劑n 電泳裝置電泳裝置穩(wěn)壓電源穩(wěn)壓電源盤狀電泳槽盤狀電泳槽 毛細滴管毛細滴管 刻度吸量管刻度吸量管 燈泡瓶燈泡瓶 玻璃管和橡膠帽玻璃管和橡膠帽 微量移液器微量移液器 注射器和長針頭注射器和長針頭 脫色搖床脫色搖床 TEMED- TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。四甲基乙二胺，避光保存。 過硫酸銨過硫酸銨( (新鮮配制新鮮配制) ) 染色液：染色液：0.10.1溴酚蘭液溴酚蘭液 洗脫液：洗脫液：7 7醋酸醋酸 其他試劑：見下表貯存液的配制。其他試劑：見下表貯存液的配制。AcrAcr和和BisBis：棕

6、色瓶保存：棕色瓶保存貯存液貯存液100ml溶液中的含量溶液中的含量pH工作溶液配制的體積比工作溶液配制的體積比11N HCl 48.Oml；Tris 36.6克克TEMED 0.23ml8.9分離膠制備：分離膠制備： 1份份1號，號，2份份2號，號，1份份水；抽氣后加入水；抽氣后加入4份份3號號；凝膠濃度凝膠濃度 7；pH= 8.92Acr 28.0克克；Bis 0.725克克3過硫酸銨過硫酸銨 0.14克克41N HCl 48.Oml；Tris 5.98克克TEMED 0.46ml6.7濃縮膠制備：濃縮膠制備： 1份份4號，號，2份份5號號；抽氣抽氣后加入后加入4份份6號號；凝膠濃凝膠濃度度

7、 2.5；pH = 6.75Acr 10.0克克；Bis 2.5克克6蔗糖蔗糖 40.0克克7電泳槽緩沖液：電泳槽緩沖液：Tris 0.60克克甘氨酸甘氨酸 2.88克克8.3用時可稀釋用時可稀釋10倍倍500ml可供可供12根電泳管根電泳管實驗步驟實驗步驟1. 1. 每人取電泳管每人取電泳管1 1支，加支，加1 1滴滴4040蔗糖于橡膠帽內(nèi)，蔗糖于橡膠帽內(nèi)，堵住電泳管底部，塞緊。堵住電泳管底部，塞緊。2. 2. 制備分離膠：制備分離膠： （可灌膠（可灌膠1212支）支） 1 1號號2ml2ml2 2號號4ml4ml水水2ml2ml在燈泡瓶中混勻，在燈泡瓶中混勻，用真空泵抽氣至用真空泵抽氣至無

8、氣泡；無氣泡；加加3 3號號8ml8ml，混勻備用混勻備用最后加最后加 用毛細滴管灌膠于電泳管中至離管口用毛細滴管灌膠于電泳管中至離管口2cm2cm處，然處，然后在距膠面約后在距膠面約1cm1cm處，沿玻管壁緩緩加入處，沿玻管壁緩緩加入3-5mm3-5mm高的水層，垂直靜置至再次出現(xiàn)界面時表明凝膠高的水層，垂直靜置至再次出現(xiàn)界面時表明凝膠已經(jīng)聚合。已經(jīng)聚合。3. 3. 分離膠的灌制分離膠的灌制4. 4. 制備濃縮膠：（可灌膠制備濃縮膠：（可灌膠1212支）支） 4 4號號 1ml1ml5 5號號 2ml2ml6 6號號 4ml4ml在燈泡瓶中混勻，在燈泡瓶中混勻，用真空泵抽氣至用真空泵抽氣至無

9、氣泡；無氣泡；加加3 3號號1ml1ml，混勻備用混勻備用最后加最后加5. 5. 吸去分離膠上層的水，灌濃縮膠于分離膠上，高吸去分離膠上層的水，灌濃縮膠于分離膠上，高約約1.5cm1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸餾水高約，然后沿管壁小心加入蒸餾水高約0.5cm0.5cm。垂。垂直放置至成膠。直放置至成膠。6. 6. 成膠后，吸干上層覆蓋水；拔去玻棒塞，吸去下成膠后，吸干上層覆蓋水；拔去玻棒塞，吸去下層蔗糖溶液。將電泳管套在橡皮塞中，裝入電泳槽，層蔗糖溶液。將電泳管套在橡皮塞中，裝入電泳槽，然后加入下槽緩沖液，排凈管底空氣。然后加入下槽緩沖液，排凈管底空氣。 7. 7. 樣品樣品制備制備血清：血

10、清：1-21-2滴滴40%40%蔗糖：蔗糖：1 1滴滴0.05%0.05%溴酚蘭：溴酚蘭：1 1滴滴于于EP管中混勻備用管中混勻備用 倒入上槽緩沖液蓋過玻管上端，排出管內(nèi)的空倒入上槽緩沖液蓋過玻管上端，排出管內(nèi)的空氣，檢查有無漏液。用微量加樣器吸樣品液氣，檢查有無漏液。用微量加樣器吸樣品液30ul30ul，加在濃縮膠上。加在濃縮膠上。8. 8. 上樣上樣9. 9. 電泳電泳上槽上槽負極；下槽負極；下槽正極正極穩(wěn)流：穩(wěn)流：1.5mA/1.5mA/管，管，3min3min 2.5mA/ 2.5mA/管，約管，約1h1h，至玻管，至玻管3/43/4處處10. 10. 剝膠剝膠 電泳完成后取下玻管，用

11、一長針頭注射器吸滿蒸電泳完成后取下玻管，用一長針頭注射器吸滿蒸餾水為潤滑劑，將針頭插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面餾水為潤滑劑，將針頭插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，緩緩旋轉(zhuǎn)玻管，一邊注水一邊使針頭呈螺旋之間，緩緩旋轉(zhuǎn)玻管，一邊注水一邊使針頭呈螺旋式推進。最后可用洗耳球在玻管濃縮膠端輕加壓力，式推進。最后可用洗耳球在玻管濃縮膠端輕加壓力，就可將凝膠柱壓出玻管。就可將凝膠柱壓出玻管。11. 11. 固定和染色固定和染色 用用7%7%醋酸固定醋酸固定3min3min； 用用0.1%0.1%溴酚藍堿性液染色溴酚藍堿性液染色5min5min（染色液回收）；（染色液回收）； 用洗脫液用洗脫液(7%(7%醋酸醋酸) )漂洗脫色漂洗脫色12. 12. 觀察結(jié)果，描出血清電泳區(qū)帶圖譜，分析有無異常觀察結(jié)果，描出血清電泳區(qū)帶圖譜，分析有無異常實驗結(jié)果實驗結(jié)果+ 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑， 對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。 制膠時，要充分搖勻，加速劑制膠時，要充分搖勻，加速劑TEMEDTEMED最后加。最