[VIP專享]第四章植物組織培養(yǎng)再生植株

1、第四章植物組織培養(yǎng)再生植株概述一、植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別1979 年國際組織培養(yǎng)協(xié)會專業(yè)術(shù)語 委員會建議將細(xì)胞培養(yǎng)的概念與 組織培養(yǎng)的概念加以區(qū)分。組織培養(yǎng)：是指從植物體中取出 組織、器官，然后模擬機(jī)體的生理條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存，形成組織或長成植株的技 術(shù)過程。細(xì)胞培養(yǎng)：是指從動植物體中 獲得細(xì)胞，然后在一定條件下培養(yǎng)，以 獲得所需的細(xì)胞或各種 產(chǎn)物的技術(shù)過程。常用的組織培養(yǎng)有莖尖培養(yǎng)、芽尖培養(yǎng)、花器培養(yǎng)、發(fā)狀根培養(yǎng)等。其中：（1）莖尖培養(yǎng)、芽尖培養(yǎng)：植物快速繁殖的常用方法；（2）花器培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)：獲得無病毒植株的重要途徑；（3）發(fā)狀根培養(yǎng)：主要目的為獲得某些次 級代謝產(chǎn)物。對于

2、植物，組織培養(yǎng)主要是我 們常見的用于植物快速繁殖的 組培技術(shù)，在名貴花、木、果種苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、種苗的脫毒、植物的大規(guī)?？焖俜敝车确矫婢哂兄匾囊?義和應(yīng)用價值。細(xì)胞培養(yǎng)主要有以次生代 謝產(chǎn)物為目的的大 規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)。二、植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用（一）在植物育種上的應(yīng)用單倍體育種：通過花藥（花粉）培養(yǎng)獲得單倍體植株，單倍體植物沒有 顯性基因的掩蓋作用，易于 選擇，用秋水仙素處理使其染色體加倍，并能在很短的 時間內(nèi)獲得純合二倍體植株，因此在育種 實踐中具有獨特的 優(yōu)越性。另外還有胚培養(yǎng)；體細(xì)胞雜交（打破物種間的生殖隔離，實現(xiàn)其有益基因的交流，改良植物品種，以致創(chuàng)造植物新 類型）；細(xì)胞突變體篩

3、選、遺傳轉(zhuǎn)化等。（二）在植物脫毒和離體快繁上的應(yīng)用應(yīng)用最多、最有效。許多植物，特別是無性繁殖植物均受到多種病毒的侵染，造成嚴(yán)重的品種退化，產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣。早在 1943 年 White 就發(fā)現(xiàn)植物生長點附近的病毒 濃度很低甚至無病毒，利用莖 間分生組織培養(yǎng)可脫去病毒，獲得脫毒植株。植物離體快繁的突出 優(yōu)點就是快速，而且材料來源 單一，遺傳背景均一，不受季節(jié)和地區(qū)等的限制，重復(fù)性好。離體快繁比常 規(guī)方法快數(shù)萬倍至百萬倍。（三）在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上的應(yīng)用利用植物 細(xì)胞組織的大規(guī)模培養(yǎng)，可以高效生 產(chǎn)各種天然化合物，如蛋白 質(zhì)、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿、天然色素以及其它活性物 質(zhì)。（四）在

4、植物種質(zhì)資源保存和交 換上的應(yīng)用利用植物 細(xì)胞組織培養(yǎng)進(jìn)行低溫或冷 凍保存，可大大節(jié)約人力、物力和土地，還可挽救那些 瀕危物種。同時離體保存的材料不受各種病蟲害侵染，而且不受季節(jié)的限制，所以利于種質(zhì)資源的地區(qū) 間及國際間的交換。（五）在遺傳、生理、生化、病理等研究上的應(yīng)用：組織培養(yǎng)由于能快速、大量地獲得性狀一致的 實驗材料，從而大大推動了植物遺傳、生理生化和病理等 領(lǐng)域的研究進(jìn)程。（六）產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)前景：花卉種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；蔬菜、水果種苗脫毒；瓜果組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。第一節(jié)無菌培養(yǎng)體系的建立與增殖細(xì)胞組織的離體培養(yǎng)屬于無性繁殖范疇。從理 論上來說，無論是細(xì)胞還是組織培養(yǎng)，再生的個體均承 傳了母體的

5、 遺傳基礎(chǔ)，這也是離體培養(yǎng)技 術(shù)作為植物快速繁殖應(yīng)用的基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)根據(jù)外植體的不同，可分 為植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)（如植物的根、莖、葉、花藥、子房、胚珠、胚等）組、織培養(yǎng)（含愈傷組織）等。根據(jù)培養(yǎng)的操作方式的不同，又可分 為：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)可分為振蕩培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)等。一、無菌培養(yǎng)體系的建立1培養(yǎng)材料的采集從理論上講，植物具有全能性的細(xì)胞有三類：（1）受精卵（2）發(fā)育中的分生 組織細(xì)胞：可取自分生組織、根尖、嫩莖、幼葉、花等；（3）雌雄配子及單倍體細(xì)胞：胚囊及卵細(xì)胞、花粉及精子細(xì)胞。在快速繁殖中，最常用的培養(yǎng)材料是莖尖，通常切 塊在 0.5cm 左右。但如果為培養(yǎng)無病毒苗，

6、通常僅取莖尖的分生 組織部分，其長度在 0.1mm 以下。2培養(yǎng)材料的消毒先將材料用自來水沖洗干 凈，最后一遍用蒸餾水沖洗，再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小 塊。在無菌環(huán)境中將材料放入70酒精中浸泡 3060s。再將材料移如漂白粉 飽和液中或 0.01升汞（Hg2Cl 2）水中消毒10min。取出后用無菌水沖洗三四次。3制備外植體在無菌的 環(huán)境中，將已消毒的材料用無菌刀、剪、鑷等，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片 則不需去皮）。然后切成 0.2 0.5cm 厚的小片。在操作中嚴(yán)禁用手觸摸材料。4接種和培養(yǎng)接種：在無菌條件下，將切好的外植體立即接種在培養(yǎng)基上，每

7、瓶接種410個。封口：接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠 帶封口。溫度：培養(yǎng)基大多應(yīng)保持在 25左右，但要因花卉種 類及材料部位的不同而區(qū)別對待。增殖：在新稍等形成后需要 繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段 轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中（增殖培養(yǎng)基一般在分化培養(yǎng)基上加以改良），增殖一個月左右后，可 視情況進(jìn)行再增殖。二、外植體的脫分化 愈傷組織誘導(dǎo)（一）愈傷組織的形成由外植體或 單個細(xì)胞形成愈 傷組織一般要經(jīng)過三個步驟：啟動期：主要是指細(xì)胞或原生 質(zhì)體準(zhǔn)備分裂的時期，需要采用合適的誘導(dǎo)劑。如通過一些刺激因素 (如機(jī)械損傷、改變光照強度、增加氧等 )和激素的 誘導(dǎo)作用，使外植體 細(xì)胞的合成代 謝活動加

8、強，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成。分裂期：即細(xì)胞開始分裂并不斷增生子 細(xì)胞的過程。分裂期是指外植體 細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo) 以后脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。處于分裂期的愈 傷組織的特點是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。外植體的脫分化因植物種 類、器官來源及其生理狀況的不同而有很大差 別。例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比 較容易，禾本科植物的脫分化比 較難；花的脫分化比 較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比 較容易，成熟的老組織脫分化比 較難。分化期：細(xì)胞內(nèi)部開始 發(fā)生一系列形 態(tài)和生理上的 變化，分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。（二）愈傷組織誘導(dǎo) 的條件一般認(rèn)為，誘導(dǎo)愈傷組織成敗的

9、關(guān)鍵主要在于培養(yǎng)的條件，其中，植物生 長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的極 為重要的因素。生長素：啟動細(xì)胞分裂的重要激素，是植物 細(xì)胞脫分化、形成愈傷組織過 程中不可缺少的物 質(zhì)。常用的種 類有 2,4-D , IAA 和 NAA , 所需濃度在 0.0110mg/L 范圍內(nèi)；細(xì)胞分裂素：能夠使已脫分化的 細(xì)胞，或細(xì)胞團(tuán)保持持續(xù)有絲分裂。常用的細(xì)胞分裂素是激 動素、玉米素和 6-BA ，使用的濃度范圍在0.110mg/L。生長素和細(xì)胞分裂素 對保持愈傷組織的快速生 長是必要的，特別是兩者結(jié)合使用時，能更強烈地刺激愈 傷組織的形成。（三）愈傷組織的增殖外植體的 細(xì)胞經(jīng)過起動、分裂和分化等一系列 變化，

10、形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。如果在原來的培養(yǎng)基上 繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織，會由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。如果要讓愈傷組織繼續(xù) 生長增殖，必須定期地 (如 24 周)將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長期保持旺盛的生 長。繼代培養(yǎng)（Subculture） 指培養(yǎng)組織在培養(yǎng)基上生 長一段時間后，營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，并已積累了一些代 謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)。（四）優(yōu)良愈傷組織的特性1. 增殖能力旺盛；2. 分散性好，容易建立 優(yōu)良的懸浮系；3. 有利于再分化，或得再生植株。第二節(jié) 體細(xì)

11、胞形態(tài)發(fā)生生物個體形成是通 過形態(tài)分生實現(xiàn)的，建立在離體培養(yǎng)基 礎(chǔ)上的形態(tài)建成稱之為體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生。在培養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞經(jīng)過再分化形成完整個體可以通過兩種途徑：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生途徑。一、器官發(fā)生途徑器官發(fā)生：培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的 過程。（一）離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式：通過器官發(fā)生形成再生植株大體上有三種方式：第一種方式是先芽后根（在芽產(chǎn)生之后，于芽形成的基部 長根而形成小植株）；第二種方式為先根后芽（在根上生長出芽來）；第三種方式是在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通 過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。（二）器官分化過程離體培養(yǎng)條件下，經(jīng)過愈傷

12、組織再分化器官一般要 經(jīng)過三個生長階段。第一階段是外植體 經(jīng)過誘導(dǎo) 形成愈傷組織。第二階段是 “生 長中心 ”形成。當(dāng)把愈 傷組織轉(zhuǎn) 移到有利于有序生 長的條件下以后，首先在若干部位成 叢出現(xiàn)類似形成層的細(xì)胞群，通常稱之為“生長中心 ”，也稱為擬分生組織，它們是愈傷組織中形成器官的部位。第三階段是器官原基及器官形成。在有些情況下，外植體不 經(jīng)過典型的愈 傷組織即可形成器官原基。 這一途徑有兩種情況：一是外植體中已存在器官原基， 進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相 應(yīng)的組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)；另一種情況是外植體某些部位的 細(xì)胞，在重新分裂后直接形成分生 細(xì)胞團(tuán)，然后由分生 細(xì)胞團(tuán)形成器官

13、原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖 為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的 實踐意義。研究表明，在葉肉細(xì)胞再生植株 過程中，最初分裂細(xì)胞的第一次分裂 軸向是十分重要的。在不經(jīng)過愈傷組織的器官分化中，這次平周分裂既是葉肉 細(xì)胞的脫分化，同時也是該細(xì)胞轉(zhuǎn)變發(fā)育方式極性的確定。 現(xiàn)在，有人把最先啟動分裂的這些細(xì)胞稱之為感受態(tài)細(xì)胞。二、體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：（一）體細(xì)胞胚的概念：離體培養(yǎng)條件下沒有 經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程中所形成的胚的 類似物，統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。（二）體細(xì)胞胚的發(fā)生途徑1. 從外植體直接 發(fā)生2. 經(jīng)胚性愈傷組織發(fā) 生3. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生（成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)

14、胞質(zhì)致密的細(xì)胞，這類細(xì)胞具有成胚能力，因而，把這類細(xì)胞團(tuán)又稱為胚性細(xì)胞團(tuán)。）（三）體細(xì)胞胚的發(fā)生過程：細(xì)胞脫分化后形成 類胚結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)歷與合子胚相似的發(fā)育過程，從球形胚、心形胚、魚雷胚到成熟胚。（四）胚狀體embryoid（）特點：1. 不同于合子胚，因為它不是兩性 細(xì)胞融合產(chǎn)生；體細(xì)胞胚與合子胚的區(qū) 別：合子胚在 發(fā)育初期具有明 顯的胚柄，而體細(xì)胞胚一般沒有真正的胚柄只有類似胚柄的 結(jié)構(gòu)。合子胚的子葉是相當(dāng) 規(guī)范的，可以作為分類的依據(jù)，而體細(xì)胞胚的子葉常不規(guī)范，有時具有兩片以上的子葉。與相同植物比 較，體細(xì)胞胚的體 積明顯小于合子胚。體細(xì)胞胚沒有休眠而體 細(xì)胞胚則直接形成植株。合子胚在胚胎

15、 發(fā)育完全進(jìn)入子葉期以后，經(jīng)過一系列的物 質(zhì)積累和脫水就 進(jìn)入休眠。2. 不同于孤雌 /雄胚，因為它不是無融合生殖的 產(chǎn)物；3. 不同于器官 發(fā)生方式形成的莖芽和根，因 為它經(jīng)歷了與合子胚相似的 發(fā)育過程且成熟的胚狀體是雙極性 結(jié)構(gòu)（即在發(fā)育的早期 階段，從其方向相反的兩端分化出及莖端和根端，而不定芽和不定根都 為單向極性。）。（五）影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素（1）外源激素對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控2，4D 的應(yīng)用有著規(guī)律性的變化。首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，然后在降低 2，4D 的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長素則有利于體 細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。（2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對體細(xì)胞

16、胚形成的影響體細(xì)胞胚的產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度的還原態(tài)氮。球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基的無機(jī) 鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。在一些試驗中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖 濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體 細(xì)胞胚的成苗率。（3）不同基因型間體細(xì)胞胚形成能力的差異體細(xì)胞胚的產(chǎn)生在不同 類型的植物 間具有明顯差異。在已成功獲得體細(xì)胞胚的植物中，以自然條件下容易 產(chǎn)生無融合生殖胚的植物 為多，且培養(yǎng)條件相對較為簡單 ，如咖啡屬植物、蕓香科植物等。三、根的誘導(dǎo)：繼代培養(yǎng)形成的不定芽和 側(cè)芽一般沒有根，必須轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。1 個月即可 獲得健壯根系。四、組培苗的練苗移栽試管苗進(jìn)

17、入自然環(huán)境前必須進(jìn)行練苗。一般先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下放 3 天，然后取出小苗，用自來水把根系上的培養(yǎng)基沖洗干 凈，再栽入已準(zhǔn)備好的基質(zhì)中（基質(zhì)使用前最好消毒）。移栽前要適當(dāng)遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度（相對速度 98左右），但基質(zhì)不宜過濕，以防爛苗。第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)常見問題及對策一、褐化現(xiàn)象及預(yù)防1. 褐化 (nonenzymatic browning reaction )的原因現(xiàn)象 :外植體在 誘導(dǎo)脫分化或再分化 過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基 釋放褐色物質(zhì)，以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之 進(jìn)一步變褐而死亡。機(jī)理：植物材料受傷后，體內(nèi)釋放的酚類物質(zhì)在酚氧化 酶

18、的作用下被氧化成褐色的醌類物質(zhì)。影響因素 :褐化主要與植物材料的基因型和生理狀 態(tài)、取材時期、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件等有關(guān)，在植物、尤其是木本植物 組織培養(yǎng)中普遍存在。2. 褐化的預(yù)防1) 選擇合適的外植體 (生理狀態(tài)、生長部位、種類和大?。阂话銇碚f，褐變隨材料的年 齡和組織木質(zhì)化程度而增加，引起褐 變的物質(zhì)也因生長季節(jié)不同而有差異。另外和外植體的種 類和大小也有關(guān)系。如：油棕的胚培養(yǎng) 較少褐變，而葉片因組織高度分化容易褐 變川。巨按的葉片由于因切割 損傷的面積大，所產(chǎn)生的酚類比莖節(jié)多。荔枝老熟的莖段揭化 嚴(yán)重，頂芽的效果 則好于側(cè)芽。 Bongs 認(rèn)為外植體越小，切面與體 積的比率越大，傷害及

19、褐變的程度就越大。在卡德 蘭新莖的培養(yǎng)中也有 類似的結(jié)果，新莖越大成活率越高2) 選擇適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件在最適宜的培養(yǎng)條件下，外植體 處于旺盛的生 長狀態(tài)，有較強的分生能力，便可大大減 輕褐化。油棕用改良 MS, 蘋果使用 1/2M5 培養(yǎng)基可減 輕褐化；在初始培養(yǎng)時把植物的外植體 處于不適合酚 類合成的條件下，如在黑暗或弱光中培養(yǎng)，可抑制酚類的氧化?？ǖ绿m開始培養(yǎng) 時，溫度保持在 1520 （溫度過高使 PPO 的活性提高，從而加速培養(yǎng)的 組織褐變，培養(yǎng)基 pH 調(diào)至 5.5，有助于減少褐化。3）使用抗氧化劑（VC、間苯二酚、硝酸鹽）4）使用吸附劑（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）5）及時繼代培養(yǎng)二、玻璃化現(xiàn)象及預(yù)防現(xiàn)象：植物組織培養(yǎng)中出 現(xiàn)的半透明狀的、畸形的 試管植物，試管苗的葉、嫩梢呈水晶透明、水浸狀，植株矮小 腫脹、失綠，葉片鄒縮卷曲，無功能性氣孔，無柵欄組織 ，體內(nèi)含水量高。機(jī)理：尚不很清楚，可能是培養(yǎng)