[VIP專享]第八章維生素的測(cè)定

1、第八章 維生素的測(cè)定本章涉及多種維生素測(cè)定方法，維生素的測(cè)定方法多種多樣，故選取有代表性的脂溶性維生素 VA/VE 的測(cè)定及水溶性維生素的測(cè)定 (VB2、 Vc)。第一節(jié)概述維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的有 30 余種，其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有 20 余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺(tái)物。維生素都具有以下共同特點(diǎn)：這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；它們不能供給機(jī)體熱能，也不是構(gòu)成組織的基本原料，主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，

2、需要量極?。凰鼈円话阍隗w內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝取長期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。測(cè)定維生素的意義：我們?cè)谠u(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)利用高含量維生素的食品資源；指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)；指導(dǎo)制定加工工藝或貯存條件；最大限量地保留各種維生素，還要控制強(qiáng)化食品中加入量，防中毒，都離不開分析檢測(cè)工作。維生素分類：脂溶性（ A 、D、E、 K ）、水溶性（ B 族、 C）測(cè)定維生素的方法有：生物鑒定法、微生物法、儀器分析法、色譜法、化學(xué)分析法。維生素的單位表示：當(dāng)維生素化學(xué)成分未清楚之前，往往無法用化學(xué)或物理方法加以測(cè)定，不能很好地表達(dá)這些物質(zhì)的量和功效，所以必

3、須通過生物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)出這種生物制品活性的高低，即所謂“效價(jià) ”，把具有一定生物效能的最小效價(jià)定為一個(gè)國際單位。1IU = 0.3 g VA = 0.025 g VD = 1.79 g -胡蘿卜素= 1.1mg - VE = 3 g VB= 50 g VC第二節(jié)脂溶性維生素的測(cè)定VA、V D 、V E、與類脂物一起存于食物中，攝食時(shí)可吸收，可在體內(nèi)積貯。脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)：1溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等非極性有機(jī)溶劑。2耐酸堿性：維生素A 、D對(duì)酸不穩(wěn)定，對(duì)堿穩(wěn)定；維生素E 對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。3耐熱

4、性、耐氧化性：維生素 A 、 D、E 耐熱性都好，維生素 A 、E 耐氧化性差，特別是 VA ，易被氧化，而維生素 D 不易被氧化。一、脂溶性維生素的一般預(yù)處理方法 皂化：根據(jù)維生素的性質(zhì)，測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常：皂化樣品經(jīng)水洗去除類脂物，有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素 (不皂化物 )，濃縮，溶于適當(dāng)?shù)娜軇y(cè)定。在皂化和濃縮時(shí)，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑 (如焦性沒食子酸、維生素 C 等)。對(duì)于 A 、D、E 共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。一、維生素 A 的測(cè)定維生素 A 存在于動(dòng)物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚肝油、蛋類、乳類等動(dòng)物性食品中。植物性食品

5、中不合 VA ，但在深色果蔬中含有胡蘿卜素，它在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)?VA ，故稱為 VA 原。（一）高效液相色譜法測(cè)定食物中VA 、VE即（ GB/T 5009.822003 中第一法）高效液相色譜法測(cè)定維生素 A/E 是近幾年發(fā)展起來的方法，此法能快速分離和測(cè)定視黃醇和它的同分異構(gòu)體、酯及其衍生物。最小檢出量分別為VA ：0.8ng； -E： 91.8ng； -E：36.6ng； -E：20.6ng。1. 原 理：食物中的維生素 A 及維生素 E 經(jīng)皂化提取以后，將其從不可皂化的部分提取到有機(jī)溶劑中。用 HPLC 法測(cè)定維生素 A 及維生素 E 的含量。2. 步 驟：（ 1）皂化：稱取 110g

6、 樣品（含維生素 A 約 3g)于皂化瓶中，加 30mL 無水乙醇，進(jìn)行攪拌， 直到顆粒物分散均勻?yàn)橹?。?50mL 10 抗壞血酸，苯并 e 芘標(biāo)準(zhǔn)液 2.00mL ，混勻。加 10mL(50%) 氫氧化鉀，混勻。于沸水浴上回餾30min 使皂化完全 。皂化后立即于水中冷卻。皂化完全的標(biāo)志是加入10m1 水，稍稍振搖，若無混濁現(xiàn)象，表示皂化完全。（ 2）提?。簩⒃砘蟮臉悠芬迫敕忠郝┒分?，用 50mL 水分 23 次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約 100mL 乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。如有殘?jiān)?，可將此液通過有少許脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗。輕輕振搖分液漏斗 2min

7、 ，靜置分層，棄去水層。（ 3）洗滌：用約 50mL 水洗滌分液漏斗中的乙醚層，水洗至水層不顯堿性，（最初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度可增加） 。（ 4）濃縮：將乙醚提取液經(jīng)過無水硫酸鈉（約 5g）濾入與球形蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約 10mL 乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉 3 次，入蒸發(fā)瓶內(nèi)，接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55°C 水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中剩下約2mL 乙醚時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)獯档粢颐?。加?2.00mL 乙醇，充分混合，溶解提取物。將乙醇液移入一小塑料離心管中，離心 5min （ 5000rpm) 。上清液供色譜分析。（ 5）色譜峰檢測(cè)：高效液相條件：分析柱 :ultrasph

8、ere ODS 5 m, 4.6mm × 25cm 流動(dòng)相 :甲醇 : 水 98:2 混勻 ,于臨用前脫氣紫外檢測(cè)器波長： 300nm進(jìn)樣量： 20L流速： 1.7mL/min（ 6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將維生素 A （維生素 E）標(biāo)準(zhǔn)品配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液（約 1mg/mL ），制備標(biāo)準(zhǔn)曲線前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。根據(jù)色譜圖求出維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，從而查得或求得維生素含量。結(jié)果計(jì)算：X = （ v/m ） ×100/1000式中： X 維生素濃度， mg/100g； 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的維生素含量， g/mL ； V 樣品定容體積， mL ；m 樣品質(zhì)量 , g

9、 ；（ 7）注意事項(xiàng)A、維生素 A 極易被破壞，應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，用棕色玻璃儀器。B、皂化過程每 5 分鐘搖皂化瓶，使皂化完全。C、提取過程振搖不應(yīng)劇烈，避免溶液乳化而不分層。D、洗滌時(shí)，最初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度可增加。E、在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)乙醚溶液不應(yīng)蒸干，以免被測(cè)樣品含量損失。F、用高純氮吹干時(shí)，氮?dú)獠荒荛_的太大，避免樣品吹出瓶外結(jié)果偏低。（二）比色法測(cè)定VA 的含量即（ GB/T 5009.82 2003中第二法）1. 原理在氯仿溶液中， VA 與三氯化銻可生成藍(lán)色可溶性絡(luò)合物，在620 nm長處有最大吸收峰，其吸光度與VA 的含量在一定的范圍內(nèi)成正比，故可比色測(cè)定。2. 適用范圍及特點(diǎn)：

10、波本法適用于維生素 A 含量較高的各種樣品 (高于 510 g g )，對(duì)低含量樣品，因受其它脂溶性物質(zhì)的干擾，不易比色測(cè)定。該法的主要缺點(diǎn)是生成的藍(lán)色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差。比色測(cè)定必須在 6S 內(nèi)滴定完成，否則藍(lán)色會(huì)迅速消退，將造成極大誤差。3. 操作步驟：（ 1） 皂化：稱取 0.55g搗碎或混勻加入 l0mL （50% ）氫氧化鉀及 20-40ml 乙醇加熱回流 30 分鐘皂化完全（檢測(cè)方法仍然是 加入 10m1 水，稍稍振搖，若無混濁現(xiàn)象，表示皂化完全 ）（ 2） 提取：皂化液移入分液漏斗用30mL 水分兩次沖洗皂化瓶用50mL 乙醚分兩次沖洗皂化瓶洗液并入分液漏斗水層放入第二分液漏斗再用

11、30mL 乙醚分兩次沖洗皂化瓶洗液傾入第二分液漏斗（反復(fù)洗水層）水層放入第三分液漏斗，醚層并入第一分液漏斗如此重復(fù)操作，直到醚層不再使三氯化銻-三氯甲烷溶液呈蘭色為止（不含VA ）。（ 3） 洗滌：在第一分液漏斗中加入 30ml 水分層后棄去水層醚層加入 1520mL 0.5molL 的 KOH 溶液（堿液提取醚溶性酸皂）棄去下層堿液用水洗滌，至水洗液不再使酚酞變紅為止醚液靜置 l020min 后，小心放掉析出的水。（ 4） 濃縮：將醚液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中用約 25mL 乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶內(nèi)水浴蒸餾，回收乙醚減壓抽干，立即準(zhǔn)確加入一定量三氯甲烷 (約 5mL

12、左右 )，使溶液中維生素 A 含量在適宜濃度范圍內(nèi)(35ugm1) 。（ 5） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確吸取維生素 A 標(biāo)準(zhǔn)溶液 0， 0.1， 0.2，0.3，0.4，0.5mL 于 6 個(gè) 10mL 容量瓶中，用三氯甲烷定容，取 6 個(gè) 3cm 比色杯順次移入標(biāo)準(zhǔn)系列使用液各 1m1，各加 1 滴乙酸酐，以維生素 A 含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。制備標(biāo)準(zhǔn)系列使用液制成標(biāo)準(zhǔn)比色系列調(diào)節(jié)光度零點(diǎn)將標(biāo)準(zhǔn)比色系列按順序移到光路前，迅速加入9mL 三氯化銻 -三氯甲烷溶液，于6s 內(nèi)測(cè)定吸光度 (每支比色杯都在臨測(cè)前加入顯色劑)。（ 6） 樣品測(cè)定取二個(gè) 3cm 比色杯，分別加入 1mL 三氯甲烷

13、 (樣品空白液 )和 1mL 樣品溶液，各加 1 滴乙酸酐。其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別測(cè)定樣品空白液和樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的維生素 A 含量。（ 7） 結(jié)果計(jì)算C 由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品溶液中維生素A 的含量， ug/mLC0 由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品空白液中維生素A 的含量， ug/mLm 樣品質(zhì)量， gV 樣品提取后加入三氯甲烷定容之體積，mL100/1000 將樣品中維生素A 是由 ugg 折算成 mg 100g 的折算系數(shù)（ 8）注 意：A、維生素 A 見光易分解，整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在暗處進(jìn)行，防止陽光照射，或采用棕色玻璃避光。B、三氯化銻腐蝕性強(qiáng)，不能沾在手上，三氯化銻遇水生

14、成白色沉淀，因此用過的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。C、顯色物質(zhì)不穩(wěn)定，測(cè)定在6S 內(nèi)完成。二、維生素 D 的測(cè)定維生素 D 是指含有抗佝僂病活性的一類物質(zhì)，具有維生素 D 活性的化合物約有 l 0 種，其中最重要的是維生素 D2、維生素 D 3 及其維生素 D 原。維生素 D 2 無天然存在，維生素 D2 只存在于某些動(dòng)物性食物中。但它們都可由維生素 D 原(麥角固醇和 7-脫氫膽固醇 )經(jīng)紫外線照射形成。維生素 D2 食多中毒。測(cè)定方法（略）：(一) 三氯化銻比色法(二)液相色譜法（教材P192 自學(xué)）它的的靈敏度較比色法高30 倍以上，且操作，簡(jiǎn)便，精度高，分析速度快。是目前分析維生素

15、D 的最好方法。是國標(biāo)及 AOAC 選定的正式方法。第三節(jié)水溶性維生素的測(cè)定水溶性維生素 B1、B2 和 C，廣泛存在于動(dòng)植物組織中，飲食來源充足。但是由于它們本身的水溶性質(zhì)，除滿足人體生理、生化作用外，任何多余量都會(huì)從小便中排出。為避免耗盡，需要經(jīng)常地由飲食來提供。水溶性維生素性質(zhì)：水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，既使加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在堿性條件下加熱，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響；維生素 B2 對(duì)光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞；維生素 C 對(duì)氧、銅離子敏感，易被氧化。水溶

16、性維生素一般預(yù)處理方法 酸解：? 維生素 C 通常采用草酸、草酸 -醋酸、偏磷酸 -醋酸溶液直接提取。? 維生素 Bl 、 B2 通常采用鹽酸水解，或再經(jīng)淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使結(jié)合態(tài)維生素游離出來，再將它們從食物中提取出來。一、維生素 B2 的測(cè)定維生素 B2 即核黃素。在食品中以游離形式或磷酸酯等結(jié)合形式存在。膳食中的主要來源是各種動(dòng)物性食品，其中以肝、腎、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆類和新鮮綠葉蔬菜。GB/T 5009.852003 中第一法為熒光法，第二法為微生物法。（ 1）原理：核黃素在 440500nm 波長光照射下發(fā)生黃綠色熒光，在稀溶液中，熒光強(qiáng)度與核黃素濃

17、度成正比。在波長 525nm 下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。試液再加入低亞硫酸鈉 (Na2S2O4),將核黃素還原成無熒光的物質(zhì)，然后再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。（ 2）酸提稱取 2-10g 樣品（約含 10-200ug 核黃素）于 100ml 三角瓶中，加入50mL0.1mol/L 鹽酸，攪拌直至顆粒分散均勻。用 40mL 瓷坩堝為蓋扣住瓶口 , 置于高壓鍋內(nèi)高壓水解， 10.3X104Pa 30min。水解液冷卻后，滴加 1mol/L 氫氧化鈉，取少許水解液，用 0.04% 溴甲酚綠檢驗(yàn)呈草綠（ pH 為 4.5）（ 3）酶解 使核黃素游離出來含有淀粉

18、的水解液：加入3ml 10% 淀粉酶溶液 ,于 3740保溫 16h。含高蛋白的水解液：加入3ml 10% 木瓜蛋白酶溶液 ,于 3740保溫 16h。過濾上述酶解液定容至100mL, 用干濾紙過濾。此提取液在4°C 冰箱中保存一周。（ 4）氧化去雜質(zhì)視樣品中核黃素的含量取一定體積的樣品提取液及核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液（約含 1-10ug 核黃素）分別于 20mL 的帶刻度試管中，加水至15mL 。各管加0.5mL 冰乙酸，混勻。加 3% 高錳酸鉀溶液 5mL ，混勻，放置 2min ，使氧化去雜質(zhì)。滴加 3% 雙氧水溶液數(shù)滴，直到高錳酸鉀顏色褪掉。劇烈震搖此管，使多余的氧氣逸出。（ 5）吸

19、附與洗脫硅鎂吸附劑約 1g 用濕法裝入柱，占柱長 1/2-2/3（約 5cm）為宜（吸附柱下端用一團(tuán)脫脂棉墊上） ，勿使柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，調(diào)節(jié)流速為 60 滴/min 。將全部氧化后的樣液及標(biāo)準(zhǔn)液通過吸附柱后，用約 20mL 的熱水洗去樣液中的雜質(zhì)，然后用 5.0mL 洗脫液（丙酮：冰乙酸：水 5：2：9）將樣品中核黃素洗脫并收集于一帶蓋 10mL 刻度試管中，再用水洗吸附柱，收集洗出液并定容至 10mL ，混勻后待測(cè)熒光。（ 6）測(cè)定于激發(fā)波長 440nm，發(fā)射波長 525nm，測(cè)量樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的熒光值。待測(cè)品及標(biāo)準(zhǔn)的熒光值測(cè)定后，在各管的剩余液（約 5-7mL ）中加 0.1mL 20% 次

20、亞硫酸鈉溶液（還原核黃素） ，立即混勻，在 20s 內(nèi)測(cè)出各管熒光值，作為各自的空白值。（ 7）計(jì)算X=(A-B/C-D)×S/m× f×100/1000式中：X 樣品中含核黃素的量 ,mg/100gA 樣品管熒光值B 樣品管空白熒光值C 標(biāo)準(zhǔn)管熒光值D 標(biāo)準(zhǔn)管空白管熒光值f 稀釋倍數(shù)m 樣品的質(zhì)量， gS 標(biāo)準(zhǔn)管中核黃素的含量 , g100/1000 將樣品中核黃素量由 g/g 折算為 mg/100g 的折算系數(shù)。二、維生素 B5 的測(cè)定：GB/T 5009.89-2003原理：某一種微生物的生長，必需有某些維生素，例如 L.arabinosus17-5 的生長

21、需要煙酸，培養(yǎng)基中若缺乏這種維生素該細(xì)菌便不能生長。在一定條件下，該細(xì)菌生長情況，以及它的代謝物乳酸的濃度是與培養(yǎng)基中該維生素的含量成正比的，因此可用酸度或混濁度的測(cè)定法來測(cè)定樣品中煙酸的含量。三、維生素 C 的測(cè)定：維生素 C 是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素 C 廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑桔等食品中含量尤豐富。維生素 C 具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成 2，3 -二酮古樂糖酸，失去生理作用。采用 2， 6-二氯靛酚滴定法測(cè)定維生素C：1.原理：1

22、） 還原型 Vc 能定量地還原 2、6-二氯靛酚（染料）2）2、6-二氯靛酚在中性或堿性溶液中顯藍(lán)色，在酸性溶液中顯粉紅色；被還原后不顯色。還原型 Vc + 染料（顯色） 氧化型 Vc + 被還原的染料（不顯色）2.試劑：（ 1）維生素 C 標(biāo)準(zhǔn)貯備液；稱取純 L- 抗壞血酸粉末 20mg，用 10g/L 草酸溶解，定容 100ml 。標(biāo)定：準(zhǔn)確吸取上述貯備液 5.0ml 于小錐形瓶中，加入 60gL 碘化鉀 0.5m1、淀粉指示劑 3 滴，混勻后用 0.001mol/L 標(biāo)準(zhǔn)碘酸鉀溶液滴定至藍(lán)色剛出現(xiàn)為止。 維生素C 貯備液質(zhì)量濃度，mg mL；V 消耗碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL ；0.088 1mL0.0010mol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液相當(dāng)于L- 抗壞血酸的量，mg mL 。（ 2）維生素 C 標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)維生素C 貯備液，