急性移植腎排斥反應(yīng)類固醇沖擊治療后淋巴細(xì)胞凋亡的作用

1、急性移植腎排斥反應(yīng)類固醇沖擊治療后淋巴細(xì)胞凋亡的作用            作者：張波 王禾 張紹增 武國(guó)軍 李欣 楊曉劍 于磊 張更【要害詞】 腎移植Study on apoptosis of tubular epithelial cells and lymphocyte in acute rejection of renal allograft after steroid pulse therapy【Abstract】 AIM: To explore the change

2、s of apoptosis of tubular epithelial cells and lymphocyte in acute rejection of renal allograft after steroid pulse therapy. METHODS: Renal biopsy specimens of 64 transplant recipients with acute rejection were examined for apoptosis. Biopsies were performed after steroid pulse therapy and were comp

3、ared with 40 transplant biopsies with unspecific organ injury of lymphocyte infiltration. Apoptosis cells of grafts were monitored by terminal deoxynucleotidyltransferasemediated dUTPdigoxigenin nick end labeling (TUNEL) analysis. RESULTS: The TUNEL showed that in the 64 cases of the acute rejection

4、 group, apoptosis of lymphocytes was found in 44 cases, that of tubular epithelial cells in 34 cases and no apoptosis in 20 cases. In the 40 cases of the control group, 24 biopsies showed tubular epithelial apoptosis (P0.2351) and 4 cases showed lymphocyte apoptosis (P0.000). According to the Banff

5、classification, 16 cases were gradeof acute rejection, 34 grade and 14 grade . lymphocyte apoptosis were found in 14 cases, 22cases and 8 cases, respectively (P=0.1530). CONCLUSION: In the acute rejection of renal allograft after steroid pulse therapy, lymphocyte apoptosis is a phenomenon predominan

6、tly restricted to rejection processes, which may be related to the prognosis of acute rejection.【Keywords】 renal transplantation; acute rejection；apoptosis【摘要】 目的: 探討在初始類固醇沖擊治療后急性腎移植排斥反應(yīng)中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的凋亡情況. 方法: 64例發(fā)生急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)的患者的腎活檢標(biāo)本，活檢均于類固醇沖擊治療后3 d進(jìn)行. 檢測(cè)活檢標(biāo)本的細(xì)胞凋亡并與40例有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的非特異腎損傷標(biāo)本進(jìn)行比較. 采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL

7、）檢測(cè)細(xì)胞凋亡. 結(jié)果: 在急性排斥組（n=64）中有44例患者標(biāo)本中觀察到淋巴細(xì)胞凋亡，34例中觀察到腎小管上皮細(xì)胞凋亡，20例中未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡. 對(duì)照組（n=40）中有24例檢測(cè)到腎小管上皮細(xì)胞凋亡(P0.2351)，淋巴細(xì)胞凋亡在4例患者中發(fā)現(xiàn)(P0.000). 根據(jù)Banff分類級(jí)排斥反應(yīng)為16例，級(jí)為34例，級(jí)為14例，檢測(cè)到淋巴細(xì)胞凋亡分別為：14例，22例和8例(P=0.1530). 結(jié)論: 在初始類固醇沖擊治療后急性腎移植排斥反應(yīng)中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞凋亡是重要的，可能與排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸有關(guān).【要害詞】 腎移植；急性排斥反應(yīng)；凋亡0引言為了探討同種異體腎移植急性排斥反應(yīng)(acute r

8、ejection, AR)類固醇沖擊治療后細(xì)胞凋亡的變化，我們采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）對(duì)患者的移植腎穿刺活檢標(biāo)本中腎小管上皮細(xì)胞及浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測(cè).1對(duì)象和方法1.1對(duì)象試驗(yàn)組為接受尸體腎移植64（男42，女22）例患者，平均年齡34歲. 供者年齡平均26歲. 供受者ABO血型相同，淋巴細(xì)胞毒交叉配合試驗(yàn)小于0.10，群體反應(yīng)抗體（PRA）陰性. 移植后常規(guī)采用環(huán)孢素A 霉酚酸酯 潑尼松治療. 急性排斥反應(yīng)發(fā)生于移植后16 mo. 急性排斥反應(yīng)發(fā)生前血Cr為(118±17) molL-1，發(fā)生中為(411±192) molL-1. 發(fā)生急性排斥后連續(xù)3 d

9、用甲基強(qiáng)地松龍（第1日500 mg，第2，3日分別為250 mg）沖擊治療. 在沖擊治療后第3日于B超或CT介導(dǎo)下用Menghini或Trucut穿刺針進(jìn)行移植腎穿刺活檢. 對(duì)照組選取有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的非排斥反應(yīng)的移植腎活檢標(biāo)本40(男26，女14)例，平均年齡35歲.1.2試劑原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（in situ cell apoptosis detection kit I，POD），購自武漢博士德公司，地高辛標(biāo)記的三磷酸脫氧尿苷（DIGDUTP），德國(guó)Bochringer Mannheim公司；末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），美國(guó)Promega公司；蛋白酶K、生物素標(biāo)記的抗地高辛抗體（A

10、ntiDIGBiotin），美國(guó)Sigma公司.1.3方法1.3.1急性排斥的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 患者有發(fā)熱、頭昏、倦怠、血壓升高、食欲減退、腹脹、并排除明顯肺部感染、上呼吸道感染、尿路感染等并發(fā)癥. 移植腎腫大和疼痛. 有局部壓痛、質(zhì)地變硬、體積增大，并排除腹水壓迫致移植腎疼痛或輸尿管梗阻. 移植腎功能減退. 表現(xiàn)為尿量減少，水、鈉潴留，體質(zhì)量迅速增加，血壓升高，血Cr迅速上升,超過原來值的25%，并排除CsA腎毒性.1.3.2標(biāo)本制備活檢標(biāo)本用升汞甲醛液固定10 min后，然后放入Db液中固定. 常規(guī)石蠟包埋，切片. 各例切片做常規(guī)蘇木素伊紅（HE）和PAS染色，顯微鏡觀察，進(jìn)行病理診斷.1.3

11、.3實(shí)驗(yàn)步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)移植腎活檢標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟至水體積分?jǐn)?shù)為3 mLL-1新鮮H2O2處理、蒸餾水洗滌；加Tris緩沖液（TBS）1100新鮮稀釋蛋白酶K，37，10 min，蒸餾水洗；加含TdT和DIGdUTP的標(biāo)記緩沖液20 L，37，2 h，TBS洗滌；加封閉液50 L，室溫30 min，甩干；加封閉液1100稀釋的抗地高辛抗體55 L，37，30 min，TBS洗滌；加TBS 1100稀釋的鏈霉親合素生物素過氧化酶復(fù)合物（SABC），37，30 min，TBS洗滌；DAB顯色20 min，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染，TBS洗；脫水，透明，封片. 顯微鏡觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡

12、細(xì)胞. 計(jì)算移植腎中10個(gè)腎小球1000個(gè)細(xì)胞中發(fā)生凋亡的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞或腎小管上皮細(xì)胞為510時(shí)用“ ”表示，1020個(gè)時(shí)為“”，>20個(gè)時(shí)為“”.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPLM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 統(tǒng)計(jì)方法為Willcoxon秩和檢驗(yàn)和2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著意義.2結(jié)果2.1急性排斥反應(yīng)組與對(duì)照組凋亡細(xì)胞分布情況在急性排斥反應(yīng)組中44例病例觀察到淋巴細(xì)胞，34例患者觀察到腎小管上皮細(xì)胞凋亡，20例未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，而對(duì)照組淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡為4例(P=0.000) ,腎小管上皮細(xì)胞凋亡為 16例(P0.2351). 說明在急性排斥反應(yīng)類固醇沖擊治療后與非急性排斥反應(yīng)患者移植腎中,

13、淋巴細(xì)胞凋亡差異具有顯著意義,而腎小管上皮細(xì)胞凋亡差異不顯著(Tab 1).    表1浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果(略)2.2Banff分類與淋巴細(xì)胞凋亡分布的關(guān)系根據(jù)Banff分類，急性排斥組中，級(jí)排斥反應(yīng)為16例，級(jí)為34例，級(jí)為14例，檢測(cè)到淋巴細(xì)胞凋亡分別為：14例(87.5%)，22例(64.7%),8例(57.1%). 急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度與淋巴細(xì)胞凋亡無關(guān)(P=0.1530).    3討論器官移植后急性排斥反應(yīng)中存在著細(xì)胞凋亡機(jī)制1-3. 同種異體移植物排斥時(shí)有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淋

14、巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性是造成移植器官損傷的主要因素4-7. 淋巴細(xì)胞(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)不但參與了自身的凋亡,而且參與了包括腎小管細(xì)胞在內(nèi)的其他細(xì)胞的凋亡. 腎小管上皮細(xì)胞又因腎小管尤其是近曲小管上皮增殖能力較強(qiáng)，對(duì)缺血、缺氧等非凡敏感，輕易受某些損傷因素的影響而凋亡. 腎小管上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在,不但在移植腎急性排斥反應(yīng)中可見到腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而且在環(huán)孢素A（CsA）腎中毒及慢性排斥反應(yīng)中亦可見到,腎小管細(xì)胞凋亡對(duì)于急性排斥反應(yīng)不具有特征性，只是器官損傷的一種反映3,8,9.以前的研究認(rèn)為，在移植物排斥反應(yīng)中出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡是基礎(chǔ)免疫抑制引起的8，卻沒有考慮類固醇沖擊后可引起細(xì)胞程序性死亡

15、這個(gè)誘導(dǎo)凋亡的途徑,而浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞對(duì)糖皮激素、免疫抑制劑等這些細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑非凡敏感. 本研究表明，在類固醇沖擊治療后急性移植腎排斥反應(yīng)中的淋巴細(xì)胞凋亡較非急性排斥反應(yīng)者差異有非常顯著意義,說明淋巴細(xì)胞凋亡是局限于急性排斥反應(yīng)中的主要現(xiàn)象.August等10的研究發(fā)現(xiàn)在急性排斥反應(yīng)中淋巴細(xì)胞凋亡發(fā)生率高的患者較低的患者預(yù)后好. 新近的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞可積極地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，主動(dòng)抑制T細(xì)胞活化,對(duì)免疫系統(tǒng)具有免疫抑制作用10-13,因此, 淋巴細(xì)胞凋亡在急性排斥反應(yīng)中的作用具有二個(gè)方面,一是浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞程序性死亡使組織損害減輕,二是由于其免疫抑制作用,在局部形成免疫抑制的微環(huán)境,主動(dòng)調(diào)節(jié)

16、細(xì)胞因子的分泌方式,使免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子由TH1向TH2轉(zhuǎn)化,從而抑制急性排斥反應(yīng)的發(fā)展. 所以，在急性排斥反應(yīng)組織中淋巴細(xì)胞凋亡具有重要意義，排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)與淋巴細(xì)胞凋亡可能有關(guān).移植腎穿刺活檢是急性排斥反應(yīng)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)14，15，細(xì)胞凋亡的檢測(cè)進(jìn)一步加深了對(duì)病情的熟悉，根據(jù)Banff分類法將急性排斥反應(yīng)分為輕、中、重3級(jí)，以探討其與淋巴細(xì)胞凋亡之關(guān)系，結(jié)果表明，急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度與移植物浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞之間無相關(guān)性，這與我們應(yīng)用定量競(jìng)爭(zhēng)RTPCR的方法通過構(gòu)建基因特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA模板，檢測(cè)急性排斥反應(yīng)患者尿中穿孔素及粒酶B mRNA水平的結(jié)果相一致. 總之，研究類固醇沖擊治療后急性移植

17、腎排斥反應(yīng)中的淋巴細(xì)胞凋亡較腎小管上皮細(xì)胞凋亡更具有重要意義，對(duì)其深入研究，有利于揭示急性排斥反應(yīng)的機(jī)制及有可能尋求一種使腎移植物中同種異體抗原激活的淋巴細(xì)胞通過凋亡機(jī)制予以清除而移植物細(xì)胞免于凋亡的途徑.【參考文獻(xiàn)】1 Porter CJ, Ronan JE, Cassidy MJ. Fasfasligand antigen expression and its     relationship toincreased apoptosis in acute renal transplant rejectionJ. Transplantation, 20

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