凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星DNA的篩選及其特性的研究

1、第16卷第1期2007年1月上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)JOURNALOFSHANGHAIFISHERIESUNIVERSITYVol.16,No.1Jan.,2007文章編號(hào):1004-7271(2007)01-0011-05凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星DNA的篩選及其特性的研究賈智英,全迎春,1,21,21(1.,150070;,)32摘,用放射性同位素2PATP標(biāo)記的(CA)15、(AT)12、(AG)12、(AAT)8、(AAG)8做探針篩選陽(yáng)性克隆。共獲得微衛(wèi)星序列152個(gè),其中二核苷酸為核心的微衛(wèi)星序列:(AG)n(AC)n(AT)n,三核苷酸為核心的微衛(wèi)星序列:(AAT)n(CAT)n(AAG)n。應(yīng)用

2、引物設(shè)計(jì)軟件primer3.0設(shè)計(jì)引物105對(duì)。選擇合成10對(duì)理論上易出現(xiàn)影子帶的引物,篩選后用31個(gè)凡納濱對(duì)蝦個(gè)體對(duì)這些引物進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果10對(duì)引物中有8對(duì)引物能擴(kuò)增出譜帶,其中1對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)影子帶,1對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為單態(tài),有6對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多態(tài)。關(guān)鍵詞:凡納濱對(duì)蝦;微衛(wèi)星DNA;重復(fù)序列;克隆中圖分類號(hào):S917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ATheisolationandcharacterizationofmicrosatellitemarkersfromLitopenaeusvannameiJIAZhi2ying,QUANYing2chun1,21,2,LIANGLi2qun,SUNXiao2wen11

3、(1.HeilongjiangRiverFisheryResearchInstituteChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China;2.CollegeofAqua2lifeSciencesandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090,China)Abstract:ThepartialgenomelibraryofLitopenaeusvannameiwasconstructedbymethodofsmallfragmentsDNAcloningandthepositiv

4、ecloneswerescreenedwiththeprobes(CA)15,(AT)12,(AG)12,(AAT)8and32(AAG)8labeledwith2PATP.152sequencescontainingmicrosatelliteswereobtained.Thedinucleotiderepeatswere(AG)n(AC)n(AT)nandthetrinucleotiderepeatswere(AAT)n(CAT)n(AAG)nrespectively.105setsofprimersweredesignedwiththesoftwareprimer3.0.10primer

5、sthatthestutterbandseasilyoccurintheoryweresynthesizedand31samplesweretestedwiththem.Eightlocicangivebandsandsixhadadegreeofpolymorphisms,onewasmonomorphicandonehadstutterbands.Keywords:Litopenaeusvannamei;microsatelliteDNA;repeatsequences;clone1凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei),俗稱南美白對(duì)蝦,原分布于南美太平洋沿岸的水域,1988

6、年引入我國(guó),因其生長(zhǎng)迅速、抗病力強(qiáng)、肉味鮮美和出肉率高而成為目前國(guó)內(nèi)外廣泛養(yǎng)殖的優(yōu)良品種之一,2在我國(guó)蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的地位,養(yǎng)殖范圍較廣。微衛(wèi)星分子標(biāo)記(microsatellitemarker)是由16bp串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成,它具有分布廣、含量大、多態(tài)性豐富及保守性等特點(diǎn),至今已被廣泛地應(yīng)用收稿日期:2006203216基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(30271010)作者簡(jiǎn)介:賈智英(1976-),女,山東蓬萊人,博士研究生,主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究。E2mail:xiaojiade41通訊作者:孫效文,E2mail:sunxw2002,Tel:0451-8484264612上海水產(chǎn)大

7、學(xué)學(xué)報(bào)16卷3-5于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位及遺傳多樣性分析等方面。目前,斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)和中6-8國(guó)對(duì)蝦(Penaeusorientalis)已篩選出較多的微衛(wèi)星序列,但對(duì)蝦間基因組的差異性大、通用性較差,據(jù)報(bào)道開(kāi)1,109對(duì)蝦屬間差異為25%,亞屬間基因組差異為9.4%。凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星篩選工作雖然已經(jīng)展,但對(duì)其各類微衛(wèi)星及微衛(wèi)星分布特征方面還知之甚少。本研究在開(kāi)發(fā)一批微衛(wèi)星序列的同時(shí),對(duì)其在基因組中分布特征進(jìn)行分析,以期深化對(duì)凡納濱對(duì)蝦基因組的認(rèn)識(shí),為開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記、開(kāi)展深入的遺傳標(biāo)記輔助育種工作奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料;(4DNA連接酶購(gòu)于MBI公司;硝

8、酸纖維素(AT12、(AG)12、(AAT)8、(AAG)8和引物由上海生物工程公司(15合成。1.2方法1.2.1總基因組DNA的提取按照梁利群等11提取基因組DNA的方法,提取基因組DNA。121.2.2文庫(kù)的構(gòu)建與陽(yáng)性克隆的篩選文庫(kù)的構(gòu)建與陽(yáng)性克隆的篩選主要參考魏東旺備按照分子克隆13的方法,并略加修改。限制性內(nèi)切酶Sau3A對(duì)基因組DNA進(jìn)行部分消化后,用蔗糖密度梯度離心篩選片斷大小為2501000bpDNA。雜交膜的制的方法進(jìn)行。1.2.3序列測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析將陽(yáng)性克隆穿刺培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中,由上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用微衛(wèi)星查找軟件TandemRepeatsFinder(Vers

9、ion2.02)進(jìn)行重復(fù)序列的查找,然后應(yīng)用NCBI上的VecScreen(/VecScreen/VecScreen.html)軟件去除載體序列,并將得到的微衛(wèi)星序列按核心序列重復(fù)次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.2.4引物設(shè)計(jì)用在線軟件Primer3.0(/genome引物設(shè)計(jì)。1.2.5引物合成及其評(píng)估software/other/primer3.html.進(jìn)行)的10對(duì)引物(見(jiàn)表在所設(shè)計(jì)的引物中,選擇合成理論上易出現(xiàn)影子帶(重復(fù)堿基數(shù)為100bp1),并用31個(gè)凡納濱對(duì)蝦個(gè)體、2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所

10、篩選的引物進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估,所用統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為等位基因頻率(allelefrequency,P)、觀測(cè)雜合度(observedheterozygosity,Ho)、期望雜合度(expectedheterozygosity,He)和多態(tài)信息含量(averagepolymorphisminformationcontent,PIC)。公式為:期望雜合度:He=1-pii=1n2nn-1n222多態(tài)信息含量:PIC=1-pi-2pipji=1i=1j=i+1其中n為等位基因數(shù)目;pi和pj分別為第i和第j個(gè)等位基因的頻率。2結(jié)果2.1重組子及其雜交本實(shí)驗(yàn)共得到5000個(gè)轉(zhuǎn)化子,EcoR和Hind雙酶切檢測(cè)重組

11、載體所占的比率為90%,所以重1期賈智英,等:凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星DNA的篩選及其特性的研究13組子數(shù)為4500。表110對(duì)微衛(wèi)星引物篩選結(jié)果及其特性Tab.1Thescreenresultsandcharacterizationoftheprimers位點(diǎn)HLJN-001HLJN-002HLJN-003HLJN-004HLJN-005HLJN-006HLJN-007HLJN-008HLJN-009HLJN-010引物序列GCACCTGAAGGACATGTGTGACAACCAGCCTGTCCTGTTTGCATCAGTAGAACAAAAGCATCAGGCCAAAAGACAATTTTGGATCCTTA

12、TAAAATGCGGCCAAATGTGCACATCTCGTTTGGATGGGAGGCTAAAAGATGGTGAGGGTGAGGCGAGCATTTTGATGCGACGGAAAATCGAGTTGTTTCCAACAAAGGAACCTCCGTACGTAAGTCCTGCAAAAGAAACTGCCGTTCAACTATATATCAGCAGCACAGTGGCAAATTTCTTGAGGCACAGAGGCTTCTCCTTGCGGAGGAAGGAGGATAAAGTTGGTTTCTGAATTTGCGTATG重復(fù)序列(AG)9GG(AG)7GG(AG)47C(GA)2A(AG)5(AAAGAA)2(AG)27(GA)4

13、2(TA)4(CA)8T(CA)41AG)43()7()(4()(AC)()7A()3(CA(CA)25CT(CA)20重復(fù)類型非完美型混合型完美型非完美型退火溫度片段大小()(bp)60.1659.62421860.59.1360.6260.6460.0460.1059.8361.3959.9657.7757.0359.3260.5360.1760.00296250235225203222249299373236(GT)3(TG)20(AGTG)2(TG)22TTC(GT)6G非完美型(GT)13(TG)4(TA)12(GA)(TAGA)4A(AT)(AG)49A(AG)10混合型(AT)(

14、AG)A(AG)10TG(GA)(AG)3A(AT)(AG)6(CT)7C(CT)(TC)5TT(TC)6(AC)6(AT)(AC)12(AT)3GT(AT)4(TA)A(AT)4(GA)4(N)57(GA)37(GAGACA)6混合型混合型用2PATP標(biāo)記的探針雜交,得到陽(yáng)性克隆168個(gè),占3.73%,其中每張膜上的信號(hào)為317個(gè),平均8.6個(gè)。322.2陽(yáng)性克隆測(cè)序及重復(fù)序列分布特征在168個(gè)陽(yáng)性雜交信號(hào)中,共測(cè)出161個(gè)序列,其中51個(gè)序列測(cè)序結(jié)果不理想,將其反向測(cè)序后,只有10個(gè)序列兩次測(cè)序結(jié)果得到了拼接。在所測(cè)得的序列中,含有微衛(wèi)星的序列一共152個(gè),重復(fù)堿基數(shù)大于或等于40的微衛(wèi)星

15、序列占總數(shù)的80.8%。統(tǒng)計(jì)所有的微衛(wèi)星序列,其中含有(AG)n、(AC)n、(AT)n、(AAT)n、(CAT)n、(AAG)n的序列所占的比率分別為45.9%、25.2%、16.0%、8.2%、3.7%、圖1凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星大小分布1.0%。以二核苷酸為重復(fù)單位的序列中,(AG)nFig.1Microsatellitesizedistributionof(AC)n(AT)n;在以三核苷酸為重復(fù)單位的序列Litopenaeusvannamei中,(AAT)n最多,其次為(CAT)n、(AAG)n,目的重復(fù)序列(AAT)n的數(shù)目多于(AAG)n,但非目的重復(fù)序列(CAT)n的數(shù)目比目的序列(A

16、AG)n多,大約是后者的3.5倍。從重復(fù)序列的次數(shù)上看,凡納濱對(duì)蝦的重復(fù)次數(shù)跨度很大,從4119不等(圖1)。2.3引物設(shè)計(jì)在152個(gè)所篩選的含有微衛(wèi)星的序列中,共設(shè)計(jì)引物105對(duì),可到農(nóng)業(yè)部北方魚(yú)類生物工程育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站()查詢。2.4引物篩選及評(píng)估10對(duì)引物中有8對(duì)引物能擴(kuò)增出譜帶,其中1對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)影子帶,1對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為單態(tài),6對(duì)14上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)16卷擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多態(tài)(表2;圖2)。除位點(diǎn)HLJN05、HLJN06外,其余6個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度較高,均在0.5以上,平均為0.7232。位點(diǎn)HLJN01、HLJN04、HLJN07、HLJ

17、N08、HLJN10多態(tài)信息含量高,而HLJN0214多態(tài)含量低,按Bostein等提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo),前5個(gè)位點(diǎn)屬于高度多態(tài)基因座,后1個(gè)為低度多態(tài)性?？傮w上各位點(diǎn)的等位基因數(shù)較多,等位基因數(shù)差異較大,平均每個(gè)位點(diǎn)12.1429,基因型豐富。除位點(diǎn)HLJN04外,經(jīng)卡方檢驗(yàn)其余位點(diǎn)觀測(cè)雜合度與期望雜合度差異均極顯著(P0.01)。這可能是由于多年來(lái)凡納濱對(duì)蝦人工選擇、非隨機(jī)交配等原因造成的。表210對(duì)微衛(wèi)星基因座的遺傳信息Tab.2Thegeneticinformationoftenpaiofprim位點(diǎn)HLJNHLJNHLJNHLJNHLJNHLJNHLJNHLJ

18、N-001002004010退火溫度()60606060片斷大小(bp)237426360250212355324445237469等位基因數(shù)7bands1189180.2400.5200-0.00000.79410.04760.26090.52760.6642-0.00000.92910.66330.73150.79480.24320.6087-0.00000.92460.60760.7208圖2凡納濱對(duì)蝦HLJN07基因位點(diǎn)的電泳圖Fig.2AnalysisofPCRproductsfortheHLJN07locusinLitopenaeusvannamei3討論微衛(wèi)星序列的篩選主要有兩種

19、方法,一是小片段克隆法,二是富集的方法。富集的方法目前應(yīng)用較多,該方法相對(duì)簡(jiǎn)單、快速,工作量小,獲取的微衛(wèi)星數(shù)目較多,但富集方法要經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增,保真15性較低,引物篩出率較差,不適合微衛(wèi)星序列較長(zhǎng)的生物微衛(wèi)星DNA的篩選,而小片段克隆法不存16在這些不足。對(duì)蝦的微衛(wèi)星序列一般較長(zhǎng),因此本次實(shí)驗(yàn)中微衛(wèi)星DNA的篩選采用了小片段克隆法。不同核心重復(fù)單元在基因組中的豐度是不同的,微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選就是以豐度為基礎(chǔ)的,因而在篩選微衛(wèi)星分子標(biāo)記之前,清楚豐度十分重要。研究表明,動(dòng)物中微衛(wèi)星DNA一般以CA/GT重復(fù)為主,植物中多以AT/TA或GA/CT重復(fù)為主。目前,已通過(guò)部分基因組測(cè)序的方法分

20、別獲得了斑節(jié)對(duì)7,17蝦、中國(guó)對(duì)蝦多種重復(fù)單元的含量。中國(guó)對(duì)蝦兩堿基重復(fù)類型中,AT重復(fù)數(shù)目最多,其次是AC和AG;三堿基重復(fù)類型中以AAT重復(fù)拷貝類別最多,其次是AAG和ATC。斑節(jié)對(duì)蝦兩堿基重復(fù)類型中,CT重復(fù)數(shù)目最多,其次是GT、AT、CG。本實(shí)驗(yàn)所篩選凡納濱對(duì)蝦兩堿基重復(fù)類型中,AG最多,其次為AC和AT;三堿基重復(fù)中,以AAT最多,其次為CAT和AAG。這一結(jié)果與中國(guó)對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦均不相9同,這也印證了“對(duì)蝦基因組間差異較大”的結(jié)論。18據(jù)Hamada等報(bào)道,人的基因組DNA中大于或等于40bp的微衛(wèi)星序列占微衛(wèi)星序列總數(shù)的12%,鼠中占43%,本實(shí)驗(yàn)得出在凡納濱對(duì)蝦中占80.8%,

21、是人類中的6.7倍,小鼠的1.9倍。在對(duì)日1期賈智英,等:凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星DNA的篩選及其特性的研究15本對(duì)蝦的研究中表明對(duì)蝦基因組中以二核苷酸為中心的重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)較多,但擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)1719影子帶現(xiàn)象嚴(yán)重,很難能篩選出較好的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。在人類中證明用三或四堿基為重復(fù)單元的微衛(wèi)星分子標(biāo)記多態(tài)性高、等位基因差異明顯和影子帶現(xiàn)象少,因而一些學(xué)者傾向于用三或四堿基核苷酸做探針進(jìn)行篩選。但對(duì)蝦中以三或四堿基核苷酸為重復(fù)單元的豐度還未見(jiàn)報(bào)道,為此,一些學(xué)者7,11在篩選對(duì)蝦微衛(wèi)星序列時(shí)不惜花費(fèi)大量的費(fèi)用對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行直接測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)借助其它對(duì)蝦所篩選的結(jié)果設(shè)計(jì)了探針,并得出了凡納濱對(duì)蝦中幾

22、種三堿基重復(fù)單元的豐度,從而深化了對(duì)凡納濱對(duì)蝦基因組微衛(wèi)星序列的認(rèn)識(shí),并為開(kāi)發(fā)其微衛(wèi)星標(biāo)記提供了技術(shù)支撐。),PCR擴(kuò)增時(shí)易發(fā)生Taq現(xiàn)在一致的觀點(diǎn)認(rèn)為重復(fù)序列較長(zhǎng)(100bp影子帶,從而干擾譜帶的計(jì)數(shù),引發(fā)計(jì)數(shù)錯(cuò)誤。,的微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)說(shuō),影子帶的現(xiàn)象并不嚴(yán)重(如圖2)的重復(fù)序列被其它的幾個(gè)堿基隔開(kāi)各種遺傳分析時(shí),。此外,本實(shí)驗(yàn)所設(shè)(HLJN06除外)。所以對(duì)蝦中微衛(wèi)星序列雖然較長(zhǎng),但如,仍是較好的分子標(biāo)記。參考文獻(xiàn):1MeehanD,XuZ,ZunigaG,etal.Highfrequencyandlargenumberofpolymorphicmicrosatellitesinculture

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