雙向電泳操作手冊(cè)

1、目錄第一章樣品制備 21.1 一般性原則 21.2 樣品制備程序 3 1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞樣品處理方法 31.2.2 組織樣品處理方法 31.2.3文獻(xiàn)報(bào)道較多的裂解液配方 4第二章第一向等電聚焦(IEF 72.1 IPG膠條的水化和電泳 72.1.1 儀器 72.1.2 試劑 72.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 72.2 IPG膠條的平衡 92.2.1 儀器 102.2.2 試劑 102.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 10第三章第二向SDS電泳 123.1 垂直SDS-PAGE 123.1.1 溶液 123.1.2 灌膠步驟 123.1.3 電泳步驟 14第四章 2-DE膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè) 154.1 考馬斯亮蘭染色

2、 154.1.1 經(jīng)典的考馬斯亮蘭染色程序 154.1.2 Neuhoff膠體考染法 154.1.3 熱考馬斯亮蘭染色及二次染色法 164.2 硝酸銀染色 16Appendix I Troubleshooting 18 Appendix II Solutions 232DE分析流程:樣品制備(Sample preparation固相pH梯度膠條的水化(IPG strip rehydration第一向等電聚焦(IEF第一向膠條的平衡( IPG strip equilibration第二向SDS電泳(SDS-PAGE檢測(cè)染色(Detection/Staining第一章樣品制備(Sample Pre

3、paration1.1一般性原則:樣品制備是雙向電泳中最為關(guān)鍵的一步,這一步處理的好壞將直接影響2-DE結(jié)果。目前并沒(méi)有一個(gè)通用的制備方法,盡管處理方法是多種多樣,但都遵循幾個(gè)基本的原則:1盡可能的提高樣品蛋白的溶解度,抽提最大量的總蛋白,減少蛋白質(zhì)的損失;2減少對(duì)蛋白質(zhì)的人為修飾;3破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用,并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。根據(jù)這一原則,樣品制備需要四種主要的試劑:離液劑(chaotropes,主要包括尿素(Urea和硫脲(thiourea;表面活性劑(sufactants,也稱去垢劑,早期常使用NP-40、TritonX-100等非離子去垢劑,近幾年較多的改用如CH

4、APS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑;還原劑(reducing agents,最常用的是二硫蘇糖醇(DTT,也有用二硫赤蘚糖醇(DTE以及磷酸三丁酯(TBP等。當(dāng)然,也可以選擇性的加入Tris-base,蛋白酶抑制劑(如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails以及核酸酶。樣品的來(lái)源不同,其裂解的緩沖液也各不相同。通過(guò)不同試劑的合理組合,以達(dá)到對(duì)樣品蛋白的最大抽提。在對(duì)樣品蛋白質(zhì)提取的過(guò)程中,必須考慮到去除影響蛋白質(zhì)可溶性和2DE重復(fù)性的物質(zhì),比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑,鹽濃度過(guò)高會(huì)降低等電聚焦的電

5、壓,甚至?xí)p壞IPG膠條;這樣都會(huì)造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過(guò)后續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償。核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理,超聲處理應(yīng)控制好條件,并防止產(chǎn)生泡沫;而加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在最終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過(guò)超速離心除去。透析可以降低鹽濃度,但時(shí)間太長(zhǎng);也可以采取凝膠過(guò)濾或沉淀/重懸法脫鹽,但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。因此,處理方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髞?lái)進(jìn)行選擇。1.2樣品制備程序:1.2.1培養(yǎng)細(xì)胞(culture cell樣品處理方法:培養(yǎng)動(dòng)物組織細(xì)胞由于沒(méi)有細(xì)胞壁,因此可以將細(xì)胞收集下來(lái),直接加入裂解緩沖液(Lysis buff

6、er抽提總蛋白。裂解緩沖液有多種配方,本實(shí)驗(yàn)室主要采用如下成份:(A 7M Urea,2M Thiourea,4%(w/vCHAPS,40mM Tris-Base, 40mM DTT,2% Pharmalyte pH 3-10.其他常用的裂解緩沖液如下:(B 9.5M urea, 2%(w/v CHAPS, 0.8%(w/v Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;(C 加入0.3-1% SDS在95o C煮樣品5mins,冷卻后加入至少5倍體積的(A或(B裂解液?？偟鞍壮樘岢绦?(1培養(yǎng)細(xì)胞的收集

7、;(2用磷酸緩沖液(PBS洗細(xì)胞3次(室溫,1000g,各2min;(3將細(xì)胞分裝到1.5ml Eppendof管中,吸干殘留的PBS;(4加入裂解緩沖液(1.5x106個(gè)細(xì)胞大約加入100µL裂解液,在室溫振蕩1h,使其充分溶解;(54o C,40,000g,離心1h;(6吸取上清并用Brandford法定量蛋白,然后分裝至Eppendof管里保存在-78o C備用。1.2.2組織樣品處理方法:對(duì)大多數(shù)從動(dòng)物或植物組織里提取總蛋白質(zhì)而言,同樣沒(méi)有一種通用的程序。但遵循的原則基本相同。下面列出一種對(duì)植物樹葉總蛋白的方法。三氯醋酸-丙酮沉淀法(TCA/acetone precipita

8、tion提取植物樹葉總蛋白程序:(1在液氮中研碎葉片;(2懸浮于含10%三氯醋酸(TCA和0.07%ß-巰基乙醇(可用DTT替代的丙酮溶液在-20 o C的冰浴;(3讓蛋白質(zhì)沉淀過(guò)夜然后離心(4o C,40,000g, 1h,棄上清;(4重懸沉淀浮于含0.07%-巰基乙醇的冰預(yù)冷丙酮溶液里;(5離心(4o C,40,000g, 1h后真空干燥沉淀;(6用(A或(B裂解液溶解沉淀,離心(4o C,40,000g, 1h。(7Brandford法定量蛋白,然后分裝至Eppendof管里保存在-78o C備用。超速離心法:(1取材;(2用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末,每1g樣品加入0

9、.5ml裂解液,使用組織勻漿器勻漿30 s;(3組織懸液15,10 000×g離心10 min;(4上清液4,150 000×g超速離心45 min;(5小心避開上層漂浮的脂質(zhì)層,吸取離心上清6 40,000g再次離心50 min;(6取離心上清。Bradford法定量,分裝后置75保存。1.2.3 文獻(xiàn)報(bào)道較多的裂解液配方Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of proteaseinhibitorsFinal concentration AmountUrea (

10、FW 60.06, Sigma,9 M 10.8 g>99.5%4% (w/v 0.8 gCHAPS (FW 614.89,Sigma, >98%Ultrapure H2O to 20 mlprepare fresh or store in aliquots at 20A cocktail of proteaseinhibitorsDTT(FW 154.25, Promega 1% 13 µL/200 µL Lysisbuffer (15.5×stock, -20Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v

11、 CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail ofprotease inhibitorsLysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5 in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base, 40 mlFinal concentration AmountUrea (FW 60.06 8 M 9.6 gCHAPS 4% (w/v 0.8 gTris base (FW 121.1Ultrapure H2O to 20 mlprepare fresh o

12、r store in aliquots at 20A cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega 1% 13 µL/200 µL Lysisbuffer (15.5×stock, -20Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitorsFinal conc. AmountUrea 5 M 3.0 gThiourea (

13、FW 76.12 2 M 1.52 gSB 3-10 (FW 307.5 2% 0.2 gCHAPS 2% 0.2 gUltrapure H2O to 10 mlA cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega 1% 13 µL/200 µL Lysisbuffer (15.5×stock, -20Lysis buffer F100 µL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v

14、glycerol注:CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。廣譜蛋白酶抑制劑混合物(如加tris可不用此混合物成分終濃度PMSF 35 µg/ml or 1 mMEDTA 0.3 mg/ml (1 mM抑肽素0.7 µg/ml蛋白酶抑制劑混合物亮肽素0.5 µg/ml其中C-F是分步法提取的4種裂解液配方, C適于提取水溶性蛋白,D是經(jīng)典配方,E適于提取膜蛋白配方,F適于提取難溶的沉淀蛋白。欲了解更詳細(xì)的樣品制備信息,可參考:/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.第二章第一向等電聚焦(IE

15、F雙向電泳的第一向IEF電泳采用IPGphor,實(shí)驗(yàn)將變得很簡(jiǎn)單。IPGphor包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(18°C-25°C和程序化電源(8000V,1.5mA?？刹捎闷胀ㄐ湍z條槽一步完成膠條的水化、上樣和電泳,大大減少操作步驟。IPGphor一次可進(jìn)行12個(gè)膠條槽的電泳(7, 11, 13 ,18 , 24cm,因采用高電壓(8000V,可縮短聚焦時(shí)間。最新推出的通用型杯上樣膠條槽因采用可移動(dòng)的上樣杯和電極,適合任何長(zhǎng)度的IPG膠條,尤其適合極性等電點(diǎn)蛋白的分離。2.1 IPG膠條的水化和電泳2.1.1儀器:IPGphor2.1.2試劑:水化液(8M尿素,2%CHAPS,15m

16、M DTT和0.5%IPG緩沖液: 水化液需當(dāng)天新鮮配制(可配成儲(chǔ)液分裝-20度保存,但不可反復(fù)凍融。尿素溶液加熱溫度不能超過(guò)37°C,否則蛋白會(huì)發(fā)生氨甲酰化。2.1.3實(shí)驗(yàn)步驟:一.加樣品水化1.用樣品溶解緩沖液(9M尿素,4%CHAPS,2%IPG緩沖液,40mM DTT,40mM Tris-base溶解樣品。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過(guò)10mg/ml,否則會(huì)造成蛋白質(zhì)的集聚或沉淀。2.吸取適量(見(jiàn)表 2.1含有樣品的水化液放入標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽中,為確保樣品充分進(jìn)入膠條中,不要加入過(guò)量的水化液。表2.1IPG膠條所需水化液體積膠條長(zhǎng)度(cm 每條需水化液體積*(µl7 12511

17、 20013 25018 35024 450*如果水化時(shí)加入樣品,此體積是加入樣品后的終體積3.從酸性端(尖端一側(cè)剝?nèi)PG膠條的保護(hù)膜,膠面朝下,先將IPG 膠條尖端(陽(yáng)性端朝標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,慢慢下壓膠條,并前后移動(dòng),避免生成氣泡,最后放下IPG膠條平端(陰極,使水化液浸濕整個(gè)膠條,并確保膠條的兩端與槽的兩端的電極接觸。4.IPG膠條上覆蓋適量 Immobiline DryStrip覆蓋油,蓋上蓋子。5.將標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端背面電極與IPGphor儀器的陽(yáng)極平臺(tái)接觸;膠條槽的平端背面電極與 IPGphor儀器的陰極平臺(tái)接觸。6.設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù):IPG膠條水

18、化的電壓,溫度和時(shí)間;等電聚焦電泳時(shí)的梯度電壓和溫度。電泳參數(shù)見(jiàn)表2.2 。表2.2 IPGphor 運(yùn)行條件溫度20°C最大電流0.05 mA per IPG strip樣品體積350 µl (180 mm 長(zhǎng) IPG strip電壓時(shí)間30 V 10-12 hours(水化,200 V 1 hour500 V 1 hour,500 -> 8000 V 30 min8000 V 3 hours (IPG 4-7; 2 hours (IPG 4-9, 3-10L, 3-10NL低電壓時(shí)水化,有利于高分子量蛋白進(jìn)入膠中,并減少蛋白形成聚集體。7.IPG膠條水化后可自動(dòng)進(jìn)

19、行等電聚焦電泳。8.暫時(shí)不進(jìn)行第二向的IPG膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-80°C保存幾個(gè)月。注意:不推薦每條IPG膠條的電流超過(guò)50µA,因?yàn)檫@有可能產(chǎn)生過(guò)多的熱量且有可能損壞膠條和槽,IPG膠條甚至?xí)z。二.不加樣品水化(一 標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽:1.用適量的水化液進(jìn)行膠條水化,方法同步驟3-5,水化過(guò)夜。2.于膠條糟的加樣孔中加入濃縮的樣品。每個(gè)加樣孔的一側(cè)可加入7.5µl 樣品(每個(gè)加樣孔分別有兩側(cè)可加樣,采用此種方法上樣,每個(gè)膠條槽最多可加入30µl樣品。3.設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù):等電聚焦電泳時(shí)的梯度電壓和溫度,電泳參數(shù)見(jiàn)表。4.進(jìn)行等電聚焦

20、電泳。5.暫時(shí)不進(jìn)行第二向的IPG膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-80°C保存幾個(gè)月。(二通用型杯上樣膠條槽:1.采用Immobiline DryStrip水化盤或標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽進(jìn)行IPG膠條的水化,加入適量的水化液進(jìn)行膠條水化,方法同步驟3-4,水化過(guò)夜。2.將通用型杯上樣膠條槽的尖端與IPGphor儀器的陽(yáng)極平臺(tái)接觸;膠條槽的平端與IPGphor儀器的陰極平臺(tái)接觸。3.將已水化的IPG膠條轉(zhuǎn)移到通用型杯上樣膠條槽。膠面朝上,先將IPG 膠條尖端(陽(yáng)性端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,膠條必需橫跨膠條槽的與IPGphor儀器的兩個(gè)電極板接觸的區(qū)域。對(duì)于7c m和11cmIPG 膠條,需將

21、IPG膠條的平端距離膠條槽平端大約1.5cm處放置,并確保膠條位于膠條槽的中央(通用型杯上樣膠條槽內(nèi)四對(duì)凸起可用于指導(dǎo)膠條放置的位置。4.在IPG膠條表面上蓋適量 Immobiline DryStrip覆蓋油(3-5ml,充滿整個(gè)膠條槽。5.取兩個(gè)IEF電極片,用去離子水浸濕后放在濾紙上,去除多余的水。6.分別將兩個(gè)IEF電極片放在IPG膠條膠的兩端,分別將電極壓在兩個(gè)電極片的外緣。7.樣品杯可放在兩個(gè)電極間除膠條槽內(nèi)側(cè)凸起外任何位置,對(duì)于堿性分離范圍的IPG膠條,盡量將樣品杯靠近陽(yáng)極放置。8.在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。9.上樣前將樣品離心去掉不溶物,每

22、個(gè)樣品杯最多可加樣100l。10.蓋上膠條槽的蓋子,再蓋IPGphor儀器的蓋子。11.設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù):等電聚焦電泳時(shí)的梯度電壓和溫度。電泳參數(shù)見(jiàn)表。2.2 IPG膠條的平衡:IPG膠條平衡兩次,每次15分鐘。平衡緩沖液包括6 M 尿素和30% 甘油,會(huì)減少電內(nèi)滲,有利于蛋白從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移。第一步平衡在平衡液中加入DTT,使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài);第二步平衡步驟中加入碘乙酰胺,使蛋白質(zhì)巰烷基化,防止它們?cè)陔娪具^(guò)程中重新氧化,碘乙酰胺并且能使殘留的DTT烷基化(銀染過(guò)程中,DTT會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)拖尾"point streaking" 。將IPG膠條輕

23、輕潤(rùn)洗,并去除多余的平衡緩沖液,然后放入第二向SDS膠中。如果縮短平衡時(shí)間,會(huì)影響一部分蛋白從IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS膠的效率。這種情況下建議在蛋白從 IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS膠后,將IPG膠條染色,以檢查是否所有蛋白都已離開IPG膠條。2.2.1儀器:玻璃管 (200 mm 長(zhǎng), 20 mm i.d., Parafilm, 振蕩儀2.2.2試劑:1. 4x分離膠緩沖液(1.5M Tris-HCl, pH8.8和0.4%(w/vSDS:45.5g Tris和1g SDS溶于200ml去離子水中,用6N HC l調(diào)節(jié)p H到8.8,最后用去離子水將體積補(bǔ)足到250ml,加入25mg疊氮鈉并過(guò)濾。此溶

24、液可于4°C儲(chǔ)存兩周。2. 平衡緩沖液(0.05 M Tris-HCl , pH 8.8,6 M 尿素, 30% (w/v 甘油和2% (w/v SDS:180 g尿素, 150 g甘油, 10 g SDS和16.7 ml分離膠緩沖液溶于去離子水中,最終將體積補(bǔ)足到500ml。此種緩沖液可于室溫下保存兩周。3. 溴酚藍(lán)溶液: 0.25% (w/v 溴酚藍(lán)溶于分離膠緩沖液中25 mg溴酚藍(lán)溶于10 ml 分離膠緩沖液中, 4°C儲(chǔ)存。2.2.3實(shí)驗(yàn)步驟:1. 使用前每10ml平衡緩沖液中加入100mg DTT (相當(dāng)于平衡緩沖液I,根據(jù)表2.3加入適量平衡緩沖液I和溴酚藍(lán)溶液

25、。取出IPG膠條分別放入玻璃管中(支持膜貼著管壁,每個(gè)玻璃管中放入一條IPG膠條,用Parafilm封口,在振蕩儀上振蕩15分鐘,倒掉平衡緩沖液 I。2. 每10ml平衡緩沖液加入400mg碘乙酰胺(相當(dāng)于平衡緩沖液II。根據(jù)下表加入適量平衡緩沖液II和溴酚藍(lán)溶液。用Parafilm封口,在振蕩儀上振蕩15分鐘,倒掉平衡緩沖液 II。表2.3 IPG膠條平衡液用量膠條長(zhǎng)度(cm 建議平衡液體積(ml/條溴酚藍(lán)溶液(µl7 2.5-5 12.5-2511 5-10 25-5013 5-10 25-5018 10 5024 15 703.用去離子水潤(rùn)洗IPG膠條一秒鐘,將膠條的邊緣置于濾

26、紙上幾分鐘,以去除多余的平衡緩沖液。4. IPG膠條的轉(zhuǎn)移:將IPG膠條放在位于玻璃板之間的凝膠面上,使膠條支持膜貼著其中的一塊玻璃板,用一薄尺將IPG膠條輕輕地向下推,使整個(gè)膠條下部邊緣與板膠的上表面完全接觸。確保在IPG膠條與板膠之間以及玻璃板與塑料支持膜間無(wú)氣泡產(chǎn)生。5. 可選操作:加入分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液與等體積的1%瓊脂糖溶液混合后,加入到IEF 上樣紙片上能得到很好的效果。終濃度為0.5%的瓊脂糖會(huì)凝聚,在施加電壓前可以防止標(biāo)準(zhǔn)蛋白的擴(kuò)散。其他可選的方法是,將標(biāo)準(zhǔn)蛋白以15-20µl的體積加入到IEF上樣濾紙片。如要減少加樣量將上樣濾紙片切成更小的面積。將上樣

27、濾紙片放在玻璃板上,將一定量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液加到上樣濾紙片上,然后用鑷子將上樣濾紙片放置在IPG膠條末端一側(cè),與板膠的凝膠表面接觸。6. 最后用瓊脂糖密封液進(jìn)行封頂,用少量的密封液(約1-1.5ml 使IPG 膠條被完全覆蓋住,在此過(guò)程中不要產(chǎn)生氣泡。第三章第二向SDS電泳目前由于更多的使用垂直的系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行第二向SDS-PAGE,故這里不再介紹水平的MultiphorII 系統(tǒng)。3.1垂直SDS-PAGE:3.1.1溶液:1. 丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液(30.8%T,2.6%C:30%(W/V丙烯酰胺和0.8%甲叉雙丙烯酰胺的水溶液。將300g丙烯酰胺和8g甲叉雙丙烯酰胺溶解于去離子水中,最

28、后用去離子水將體積補(bǔ)足到1000ml。過(guò)濾后可于4°C儲(chǔ)存兩周。2. 分離膠緩沖液(1.5M Tris-HCl, pH8.6和0.4%(w/vSDS:90.85gTris和2gSDS溶于400ml去離子水中,用6N HC l 調(diào)節(jié)p H到8.6,最后用去離子水將體積補(bǔ)足到500ml,加入50mg疊氮鈉并過(guò)濾。此溶液可于4°C儲(chǔ)存兩周。3. 10%(w/v過(guò)硫酸銨溶液:1g過(guò)硫酸銨溶于10ml去離子水中。此溶液需使用前新鮮配制。4. 覆蓋液(緩沖液飽和的異丁醇:混合20ml上述分離膠緩沖液和30ml異丁醇,等幾分鐘后去掉異丁醇層。5. 取代液(50%(v/v甘油和0.01%溴

29、酚藍(lán)水溶液:混合250ml甘油(100%和250ml去離子水,再加入50mg溴酚藍(lán),攪拌幾分鐘。6.低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液:含有0.5%(w/v低熔點(diǎn)瓊脂糖的電極緩沖液。3.1.2灌膠步驟:根據(jù)第一向IEF電泳時(shí)IPG膠條的大小選擇第二向合適的垂直電泳槽。最新推出的Ettan DALT II 是為大規(guī)模、高通量、高重復(fù)性雙向電泳第二向SDS-PAGE專門設(shè)計(jì)的。同時(shí)進(jìn)行12塊26 x 20cm板膠電泳,適于長(zhǎng)至24cmIPG膠條。其灌膠模具每次最多可灌制14塊膠。通常不需要濃縮膠。表3.1 凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍膠濃度分離范圍(KD5% 36-2007.5% 24-20010% 14-20012

30、.5% 14-10015% 14-60表2.3 灌制垂直SDS膠的配方10%T,2.6%C12.5%T,2.6%C15%T,2.6%C單體貯存液4x分離膠緩沖液10%SDS去離子水33.3ml25ml1ml40.2ml41.7ml25ml1ml31.8ml50ml25ml1ml23.5mlTEMED*過(guò)硫酸銨*(10%33µl500 µl33 µl500 µl33 µl500 µl最終體積100ml 100ml 100ml*TEMED和過(guò)硫酸銨在灌膠前再加膠的組成:分離膠:10%T、12.5%T或15%T的均勻膠,2.6%C,0.1%

31、SDS, 375mM Tris-HCl PH8.8垂直電泳儀器類型配制凝膠溶液體積(ml MiniVE or SE260(10X10.5cm玻璃板1mm厚的膠101.5mm厚的膠15SE600(18X16cm玻璃板1mm厚的膠301.5mm厚的膠45Ettan DALT II(26x20cm膠14塊1mm厚的膠9501.按儀器說(shuō)明書裝好灌膠模具,倒入凝膠溶液(在Hofer DALT 和 Ettan DALT II的灌膠模具中,拔掉灌膠的膠管后,取代液會(huì)把管道中剩余的凝膠溶液壓入模具中。在每塊膠的上面加入覆蓋液以得到平的凝膠上樣平面。2.灌膠后立即在每塊凝膠上鋪上一層用水飽和的正丁醇或異丁醇,以

32、減少凝膠暴露于氧氣,形成平展的凝膠面。3.同時(shí)灌制多塊凝膠時(shí),室溫下至少聚合3小時(shí)。聚合后倒掉覆蓋在凝膠上的正丁醇溶液,并用凝膠儲(chǔ)存液沖洗凝膠表面。4.暫時(shí)不需要的凝膠可用塑料薄膜包好于4°C保存1-2天。將整個(gè)凝膠模具完全浸沒(méi)在凝膠儲(chǔ)存液中可4°C條件下保存1-2周。3.1.3電泳步驟:1.電泳槽中裝滿電泳緩沖液,并打開溫控系統(tǒng),調(diào)節(jié)溫度為15°C。2.將平衡好的IPG膠條浸入電極緩沖液中幾秒鐘。3.將IPG膠條小心的放置于SDS膠面上,并輕壓使IPG膠條與SDS膠面充分結(jié)合,上面覆蓋2ml熱的瓊脂糖溶液(75°C,使瓊脂糖在5分鐘內(nèi)凝固。其余的IPG

33、膠條重復(fù)上述操作。4.將膠盒插入電泳槽中,開始電泳。采用垂直的SDS膠電泳,不必象水平電泳一樣,電泳過(guò)程中去除IPG膠條。6. 當(dāng)溴酚藍(lán)染料遷移到膠的底部邊緣即可結(jié)束電泳。7. 跑好的膠轉(zhuǎn)移到染色盒里固定,準(zhǔn)備染色。附1:SE600系統(tǒng)電泳參數(shù):Constant current, 15o CPhase Current Duration1 10mA per gel 15 min2 20mA per gel Approximately 5 h附 2:Ettan Dalt II系統(tǒng)電泳參數(shù):Constant power, 20o CPhase Current Duration1 5w per gel

34、 45 min2 20w per gel Approximately 6 h第四章 2-DE膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)2-DE膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)方法大致有:1考馬斯亮蘭染色法;2銀染法;3負(fù)染法;4熒光染色法;5放射性同位素標(biāo)記法等。這幾種檢測(cè)方法的靈敏度各不相同。目前最常用的是銀染法和考染法。由于銀染的靈敏度是考染的50倍,故一般用銀染法進(jìn)行分析處理,再用考染法來(lái)進(jìn)行樣品微量制備。4.1考馬斯亮蘭染色:4.1.1經(jīng)典的考馬斯亮蘭染色程序:1 固定 20 % TCA 1h2 染色 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h3 脫色 40% EtOH&10% ac

35、etic acid 2x 30 min4 強(qiáng)化 1% acetic acid overnight5 清洗 deionized H2O 30 min局限:靈敏度低(1g protein/spot4.1.2 Neuhoff膠體考染法:1 固定:12%(w/v三氯醋酸(TCA 2h2 染色:200ml染色液混合50ml甲醇 16-24h染色液:在490ml含2%(w/v的H3PO4中加50g (NH42SO4直至完全溶解,再加0.5g CBB G-250(已溶于10mlH2O中,攪拌混合。無(wú)需過(guò)濾,使用前搖勻。3 漂洗:10.1 m ol/L Tris-H3PO4緩沖液(pH 6.5漂洗兩分鐘;22

36、5%(v/v甲醇漂洗不超過(guò)1min4 穩(wěn)定:在20%的(NH42SO4中穩(wěn)定蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物。優(yōu)點(diǎn):背景低,靈敏度高,可達(dá)到200ng protein/spot.4.1.3 熱考馬斯亮蘭染色及二次染色法:1 染色(0.025%(w/v考馬斯亮蘭R350:將1片 Phast Gel Blue 藥片溶入 1.6L 10%醋酸,將染色液加熱到90o C倒入凝膠染色盤,振蕩10min;2 脫色:10%醋酸室溫振蕩脫色2h,期間需多次更換脫色液,脫色液可通過(guò)鋪有活性炭的濾紙層過(guò)濾回收;脫色液和染色液可重復(fù)使用。脫色后的凝膠可進(jìn)行掃描分析,選中的點(diǎn)可用Spot Picker自動(dòng)切膠儀挖出,再進(jìn)行后續(xù)的硝

37、酸銀染色可得到更多的蛋白點(diǎn)。用考馬斯亮蘭預(yù)染過(guò)的膠再進(jìn)行銀染靈敏度比單獨(dú)銀染更高,且熱染過(guò)程迅速。二次染色待考馬斯亮蘭染色后的背景完全脫除后,可用以下的銀染法進(jìn)行二次染色。因?yàn)榈鞍c(diǎn)已經(jīng)經(jīng)過(guò)固定,可直接從敏化步驟開始染色。4.2硝酸銀染色:銀染的方法種類很多,目前有文獻(xiàn)報(bào)道的就有100多種。但是其準(zhǔn)確的染色機(jī)制還不是特別的清楚。大致的原理是銀離子在堿性p H環(huán)境下被還原成金屬銀,沉淀在蛋白質(zhì)的表面上而顯色。由于銀染的靈敏度很高,可染出膠上低于1 ng/蛋白質(zhì)點(diǎn),故廣泛的用在2D凝膠分析上。待找到自己感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)后,再通過(guò)考染富集該目的點(diǎn),然后做進(jìn)一步的肽段指紋圖譜分析(PMF或序列測(cè)定。隨

38、著質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,對(duì)銀染后的f mol級(jí)的蛋白質(zhì)點(diǎn)直接測(cè)定已非難事。這里介紹一種可兼容質(zhì)譜分析的銀染方法,實(shí)驗(yàn)程序如下:Step Solution (250ml per gel Gel Type1mm unbacked 1mm on film or glass support or 1.5 unbacked固定25ml acetic acid, 100ml methanol 2x15 min 2x60 min125ml milli-Q water30 min 60 min敏化75ml methanol, 0.5g Na2S2O3, 17gNaAc, milli-Q water to

39、250ml漂洗250ml milli-Q water3x5 min 5x8 min銀染0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml20 min 60 min漂洗250ml milli-Q water2x1 min 4x1 min4 min 6 min顯色 6.25g Na2CO3, 100µl formaldehyde,milli-Q water to 250ml終止 3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml10 min 40 min漂洗250ml milli-Q water3x5 min 2x30 min銀染注意事項(xiàng):1.

40、很多銀染程序都使用了戊二醛(glutardialdehyde,它能提高銀染的靈敏度和染色結(jié)果的重復(fù)性,但是因?yàn)槲於?huì)修飾蛋白質(zhì),從而會(huì)影響對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定和分析;2. 保證所有的染色器皿絕對(duì)的干凈,可使用玻璃或塑料做染色器皿;3. 水的純度對(duì)染色結(jié)果好壞影響是很大的,至少要用雙蒸水(導(dǎo)電率<2S,有條件的可使用Millipore water;4. 染色過(guò)程中避免手去接觸凝膠,必須戴上一次性手套或無(wú)粉乳膠手套;5.所用的化學(xué)試劑一定是要分析純(AR。Appendix I: Troubleshooting1.總的策略化學(xué)試劑純度要高,至少是分析級(jí),目前國(guó)產(chǎn)試劑達(dá)不到純度要求使用去離子水

41、(電導(dǎo)<2uS尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鮮配制Deionize urea prior to use包含尿素的溶液加熱溫度不超過(guò)37°C,否則會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)氨甲酰化過(guò)濾所有的溶液,使用干凈無(wú)灰塵的容器2.樣品制備樣品提取緩沖液(裂解緩沖液必須新鮮配制?；蛘叻盅b成1ml,于-78°C冷凍保存,裂解緩沖液一旦溶解不能再冷凍如有必要,在細(xì)胞裂解時(shí)加入蛋白酶抑制劑。注意:幾種蛋白酶抑制劑在DTT或-巰基乙醇存在時(shí)失效40000g離心1小時(shí)以去除蛋白提取液中的不溶物3.灌膠過(guò)硫酸銨溶液需新鮮配制。40%過(guò)硫酸銨溶液儲(chǔ)存于冰箱中只能使用2-3天,低濃度過(guò)硫酸銨溶液只能當(dāng)天使用T

42、EMED需在氮?dú)庀聝?chǔ)存,每6個(gè)月?lián)Q一次帶U型框的玻璃板需用疏水硅烷處理,避免膠聚合后與玻璃板粘連水平SDS濃縮膠中加入甘油(37.5%的目的是為了減少電內(nèi)滲如果SDS膠結(jié)合于GelBond PAG膜上, GelBond PAG膜需用去離子水洗6次,每次10分鐘,以避免銀染過(guò)程中產(chǎn)生點(diǎn)托尾膠聚合不完全的可能原因解決辦法TEMED或過(guò)硫酸銨時(shí)間太長(zhǎng)替換TEMED和過(guò)硫酸銨SDS膠:Tris緩沖液的pH值用HCl調(diào)Tris緩沖液的pH6.8或8.8膠從塑料支持膜上脫落的可能原因解決辦法膠聚合于GelBond PAG膜的疏水面膠必須聚合于GelBond PAG膜的親水面塑料支持膜選擇錯(cuò)誤(如:用于瓊脂

43、糖膠 選擇專門用于聚丙烯酰胺膠的支持膜GelBond PAG膜過(guò)期不要使用超過(guò)一年的 GelBond PAG膜膠結(jié)合于玻璃板上的原因解決辦法玻璃板沒(méi)有疏水處理玻璃板用疏水硅烷處理4.IPG膠條的水化IPG膠條需水化到0.5mm厚IPG膠條的的水化時(shí)間取決于水化緩沖液的組成。如果尿素(>8M和去污劑(>1%濃度過(guò)高,至少需水化6小時(shí),最好過(guò)夜采用Multiphor II做第一向電泳時(shí),水化后的IPG膠條需用去離子水清洗,否則IPG 膠條表面會(huì)有尿素結(jié)晶,干擾IEF。(使用IPGphor時(shí),IPG膠條水化后不必清洗IPG膠條水化時(shí),其膠面與水化盤或膠條槽之間避免產(chǎn)生氣泡。采用膠條槽水化

44、時(shí),膠條上需覆蓋硅油以防水化液揮發(fā)5.第一相IEF5.1采用樣品杯上樣樣品體積不能少于20l樣品在陰極或陽(yáng)極附近上樣,未知樣品需檢查在何處上樣,結(jié)果更好樣品濃度不能過(guò)高(最大10mg/ml,以避免在上樣位置生成蛋白沉淀。如果懷疑,最好用裂解緩沖液稀釋,增大上樣體積樣品溶液中不能含高濃度的鹽。脫鹽或用裂解緩沖液稀釋,低電壓使樣品慢慢進(jìn)入膠中5.2水化時(shí)加入樣品樣品溶液體積需根據(jù)IPG膠條大小調(diào)整(18cm長(zhǎng)I P G膠條約需400l樣品溶液,以保證水化后沒(méi)有多余的樣品留在水化盤中。最好檢查高分子量蛋白、堿性蛋白或膜蛋白是否進(jìn)入IPG膠中5.3等電聚焦使用IPG膠條時(shí),不要進(jìn)行預(yù)聚焦,否則會(huì)因?yàn)槟z

45、的電導(dǎo)非常低導(dǎo)致樣品很難進(jìn)入膠條為使樣品進(jìn)入膠的效率增加,采用30V低電壓水化;繼續(xù)以低電壓梯度(200V,500V,1000V各1小時(shí)進(jìn)行電泳,最后達(dá)到8000V的進(jìn)行電泳聚焦時(shí)間跟IPG膠條的長(zhǎng)度、p H范圍有關(guān)。短的IPG膠條或?qū)抪H梯度范圍IPG膠條,聚焦時(shí)間短IEF結(jié)束后,如果IPG膠條暫時(shí)不進(jìn)行第二向電泳,可于-78°C冷凍保存上樣附近有水析出是因?yàn)闃悠符}濃度過(guò)高,可脫鹽或稀釋樣品,低電壓上樣,延長(zhǎng)樣品進(jìn)入膠的時(shí)間6. IPG膠條平衡和第二相(SDS-PAGE平衡時(shí)間應(yīng)該充分長(zhǎng)(至少2 x 10分鐘平衡緩沖液包括Tris-HCl(pH8.8,SDS(1%,高濃度尿素(6M

46、和甘油(30%提高蛋白質(zhì)的溶解度并減少電內(nèi)滲。第一步加入DTT(1%是為了使蛋白去折疊;第二步加入碘乙酰胺是為了去除多余的DTT(銀染過(guò)程中,DTT會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)拖尾對(duì)于非常疏水的蛋白或含有二硫鍵的蛋白,相對(duì)于DTT和碘乙酰胺, tributylphosphine更有效水平的SDS-PAGE:濃縮膠中加入大量的甘油(37%是為了減少電內(nèi)滲水平的SDS-PAGE:濃縮膠的長(zhǎng)度至少超過(guò)25mm蛋白從一向(IPG膠條到二向(SDS膠的轉(zhuǎn)移為避免點(diǎn)拖尾和損失高分子量蛋白,應(yīng)緩慢進(jìn)行(場(chǎng)強(qiáng)<10V/cmSDS膠垂直拖尾的可能原因解決辦法水平SDS-PAGE:濃縮膠長(zhǎng)度太短有效的濃縮膠長(zhǎng)度>25mm

47、蛋白沒(méi)有被SDS充分包裹平衡緩沖液SDS濃度>1%,平衡 2 x 15分鐘糖蛋白用硼酸緩沖液代替Tris緩沖液用寬范圍小孔梯度膠蛋白去糖基化部分自由的巰基再次氧化生成二硫鍵聚合物平衡緩沖液中加入充足的DTT,使蛋白烷基化用tributylphosphine 代替DTT和碘乙酰胺蛋白發(fā)生氨甲?；心蛩氐娜芤杭訜釡囟炔荒艹^(guò)37°C使用前,尿素去離子化(deionize urea樣品制備時(shí),內(nèi)源的蛋白酶沒(méi)有被抑制TCA-丙酮處理使蛋白酶失活加SDS或蛋白酶抑制劑一起煮沸GelBond PAG膜使用前沒(méi)有清洗使用前,用去離子水洗6 x 10分鐘灰塵或多余的DTT 過(guò)濾所有的緩沖液第

48、二步平衡緩沖液中加入碘乙酰胺去除多余的DTT雙向電泳圖譜部分變形的可能原因解決辦法IPG膠條中NP-40或Triton X-100濃度過(guò)高如果可能減少NP-40/Triton的量用CHAPS代替NP-40/Triton蛋白從一向到二向轉(zhuǎn)移完成后,IPG 膠條沒(méi)有從水平的SDS膠上取走第二向采用水平SDS-PAGE時(shí),蛋白從一向到二向轉(zhuǎn)移完成后,取走IPG膠條緩沖液條沒(méi)有覆蓋SDS膠上原IPG 膠條結(jié)合的位置第二向采用水平SDS-PAGE時(shí),取走IPG 膠條后,將緩沖液條前移,恰好覆蓋IPG 膠條與SDS膠結(jié)合位置的前沿溴酚藍(lán)遷移前沿不平的可能原因解決辦法水平SDS-PAGE:冷卻板和GelBo

49、ng PAG膜之間有氣泡去除氣泡水平SDS-PAGE:緩沖液條和膠面結(jié)合不好輕壓緩沖液條,使其與膠面充分結(jié)合SDS小孔梯度膠灌膠和聚合時(shí)不水平采用水平臺(tái)灌膠7. 銀染使用純度高(分析級(jí)的化學(xué)試劑使用高純?nèi)ルx子水或雙蒸水(電導(dǎo)<2uS使用干凈無(wú)灰的容器不要用手去碰膠,帶手套或使用鑷子SDS膠上只能看見(jiàn)很少(或沒(méi)有蛋白的可能原因解決辦法樣品制備方法不合適(蛋白濃度低 做雙向電泳前,估計(jì)樣品中蛋白濃度蛋白進(jìn)入IPG膠條不充分采用低電場(chǎng)強(qiáng)度開始IEFIPG膠條和SDS膠之間結(jié)合不好輕壓IPG膠條,使其與SDS膠充分結(jié)合蛋白從一向到二向轉(zhuǎn)移效率低采用低電場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)移;用去污劑提高蛋白的溶解度

50、IPG膠條GelBond面與SDS膠結(jié)合水平SDS-PAGE:IPG膠條膠面朝下銀染方法不正確檢查方法甲醛氧化用新的甲醛顯色液pH值不正確檢查顯色液p H值SDS膠上丟失低分子量或高分子量蛋白的可能原因解決辦法低分子量蛋白沒(méi)有被充分固定用20%TCA或戊二醛代替40%乙醇和10%乙酸蛋白酶降解高分子量蛋白使樣品中內(nèi)源性蛋白酶失活高分子量蛋白從一向到二向轉(zhuǎn)移效率低采用低電場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)移膠的背景臟解決辦法樣品中內(nèi)源性蛋白酶沒(méi)有失活使樣品中內(nèi)源性蛋白酶失活銀染中清洗步驟不充分進(jìn)行足夠次數(shù)的清洗步驟兩性電解質(zhì)和SDS或其它去污劑形成的復(fù)合物膠固定的時(shí)間>3小時(shí)或過(guò)夜,充分清洗去除復(fù)合物試劑質(zhì)

51、量差使用分析級(jí)或更好的試劑水的質(zhì)量差電導(dǎo)<2uS水化盤或膠條槽被蛋白污染徹底清洗水化盤或膠條槽Appendix II: Solutions常用試劑的配方:A.裂解液(lysis solution(8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pha rmalyte3-10, 40 mlFinal concentration Amount Urea(Fw 60.06 8M 19.2gCHAPS 4%(w/v 1.6gPha rmalyte3-10 2% 800µlDouble distilled H2O To 40ml新鮮配制或者分裝貯存于-201.如果需要,尿素的濃度可以調(diào)高到9或

52、者9.8M,也可用7MUrea,2MThoiurea.2.其他的去垢劑(如TritonX-100,NP-40,還有其它的非離子去垢劑或者雙性離子去垢劑可以取代CHAPS.3.如果需要,蛋白質(zhì)酶的抑制劑和或者還原劑可以加入。B.水化液(不含有IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG buffer (8M Urea, 2% CHAPS, bromophenol blue,25mlFinal concentration Amount Urea (FW 60.06 8M 12gCHAPS 2%(w/v 0.5g Bromophenol blu

53、e 0.002%(w/v 50µl Double distilled H2O To 25ml分裝貯存于-201.DTT和IPGbuffer在用之前加入:每2.5ml水化液加7mgDTT.如果膠內(nèi)上樣,則樣品液在用之前加入到2.5ml的水化液中。0.如果需要,尿素的濃度可以調(diào)高到9或者9.8M.3.其他的去垢劑(如TritonX-100,NP-40,還有其它的非離子去垢劑或者雙性離子去垢劑可以取代CHAPS.溴酚藍(lán)儲(chǔ)液Final concentration Amount Bromophenol blue 1% 100mgTris-base 50mM 60mgDouble distill

54、ed H2O To 10mlC.水化液(含有IPG buffer, Rehydration stock solution with IPG buffer(8M Urea, 2% CHAPS, 0.5% or 2% IPG buffer, bromophenol blue,25mlFinal concentration AmountUrea (FW 60.06 8M 12gCHAPS 2%(w/v 0.5g0.5%or 2%(v/v 125 or 500µlIPG buffer(same pH rangeas the IPG stripBromophenol blue 0.002%(w

55、/v 50µl 1% solution Double distilled H2O To 25ml分裝貯存于-201.DTT和IPGbuffer在用之前加入:每2.5ml水化液加7mgDTT.如果膠內(nèi)上樣,則樣品液在用之前加入到2.5ml的水化液中。2.IPGbuffer的濃度取決于所用的等電聚焦系統(tǒng)和IPG膠條的pH范圍。3.如果需要,尿素的濃度可以調(diào)高到9或者9.8M。4.其他的去垢劑(如TritonX-100,NP-40,還有其它的非離子去垢劑或者雙性離子去垢劑可以取代CHAPS.5.濃度為0.5%的IPGbuffer用125l IPG buffer ,濃度為2%則用500l。D.平衡液(SDS equlibration buffer(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200