培本方拆方調(diào)節(jié)哮喘大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素作用途徑的實驗研究

1、培本方拆方調(diào)節(jié)哮喘大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素作用途徑的實驗研究    【摘要】  目的研究培本方對哮喘大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素（GC）各作用途徑的調(diào)節(jié)作用。方法采用OVA（卵蛋白）致敏、激發(fā)復制大鼠慢性哮喘模型，以阿斯美膠囊為對照藥，通過放免法檢測血清CORT（皮質(zhì)酮）、血漿ACTH（促腎上腺皮質(zhì)激素）和下丘腦CRH（促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素）的含量及免疫組化法檢測肺組織GCR（糖皮質(zhì)激素受體）的表達，探討培本方及其拆方對大鼠哮喘模型的部分作用機制。結(jié)果模型對照組較正常對照組CORT及ACTH含量均顯著降低、GCR蛋白表達亦明顯降低、CRH含量無明顯改變

2、；培本方全方組及拆方組改善CORT，ACTH，GCR的影響作用更為顯著。結(jié)論 調(diào)節(jié)內(nèi)源性GC的作用途徑可能是培本方抗哮喘作用的機制之一。 【關(guān)鍵詞】  培本方 拆方 內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素 哮喘 大鼠AbstractObjectiveTo study the adjustment of Peibenfang on the functional route of endogenous GC in asthma rats. MethodsAsthma rats model was established by OVA through sensitizing and challenging. A

3、simei Capsule was used as positive control medicine. By investigating CORT in blood serum, ACTH in blood plasma, CRH in hypothalamus and GCR in the lung issue, the effects of Peibenfang on asthma were observed.ResultsThe levels of CORT, ACTH and GCR in model group were lower than those in normal gro

4、up; in Peibenfang group and Peibenfang compatibility group(part), these indexes increased remarkably. ConclusionOne of the mechanisms of Peibenfang against asthma is to adjust the functional route of endogenous GC in asthma.Key wordsPeibenfang;   Compatibility;   Endogenous GC;&#

5、160;  Asthma ;   Rats    哮喘反復發(fā)作可導致內(nèi)源性GC濃度下降，體內(nèi)低濃度的GC會加重哮喘的炎癥反應，形成惡性循環(huán)，同時不足的應激激素反應將增加過敏性哮喘的易感性，也許這是哮喘長期反復發(fā)作的機理之一。培本方是由著名老中醫(yī)徐輝光教授積30余年臨床之經(jīng)驗，根據(jù)中醫(yī)“久病成虛”“緩則治本”的理論，獨樹一幟創(chuàng)立的以平補氣血陰陽藥物為主組成的復方，作為支氣管哮喘患者緩解期用藥，在臨床上取得了較好的療效。本實驗旨在探討培本方通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性GC的作用途徑用于哮喘防治的機制。1  材料和方法1.1  動物雄

6、性健康SD大鼠，清潔級，60只，體重（130±10）g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。動物批號：SCXK（滬）2003-0002。1.2  藥品、試劑及儀器大鼠CORT試劑盒，美國DSL；ACTH放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；神經(jīng)肽-CRH放免藥盒，第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室；GCR一抗（R），美國Santa Cruz；免疫組化EnVision 試劑盒（即用型），丹麥Dako公司；卵蛋白OVA，美國sigma公司；402A超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司。實驗所需中藥材由上海康橋中藥飲片有限公司提供。阿斯美膠囊，日本三共株式會社。1.3  動物模型

7、復制SD大鼠60只，隨機分成6組，即正常對照組、模型對照組、培本方全方組、培本方拆方組（由全方中補益氣血的藥物黃芪、當歸組成）、培本方拆方組（由全方中補益陰陽的藥物淫羊藿、女貞子組成）、阿斯美組，每組10只。    于實驗第0，7天，除正常對照組給予1%氫氧化鋁佐劑，各組動物均以新鮮配制的致敏液（1 mg/ml OVA，溶于1%氫氧化鋁佐劑內(nèi)）作皮下注射，每鼠在兩側(cè)后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10點，每點注射0.05 ml，同時腹腔注射0.5 ml，共計1 ml。于實驗第14天開始，將大鼠置于自制霧化箱（40 cm×30 cm×20 cm）

8、內(nèi)，用超聲霧化器以霧化量0.8 ml/min霧化1%OVA生理鹽水溶液15 min，1次/d，以激發(fā)哮喘。正常對照組霧化以生理鹽水。 連續(xù)激發(fā)3周后，停止激發(fā)6 d，然后激發(fā)1次，24 h后處死。1.4   給藥方法于實驗第14天開始灌胃給藥，1次/d，直至處死前1日。培本方全方組、培本方拆方組、培本方拆方組、阿斯美組，分別按1 ml/100 g體重灌胃給予相應的水煎液，給藥量分別為23.2，8.2，9.5，25.11 mg?kg-1?d-1。正常對照組和模型對照組：按1 ml/100 g體重灌胃給予生理鹽水。1.5  標本制備及檢測血液：25%烏拉坦4 ml/k

9、g腹腔注射，腹主動脈取血， 2 ml注入事先加入30 l EDTA-二鈉和40 l抑肽酶的離心管內(nèi)，立即顛倒混合，4靜置，離心取血漿；其余血液室溫靜置后離心，取血清。    肺組織：迅速開胸，取出肺組織，適量剪取左肺上部，浸泡于10%中性甲醛緩沖液中固定，脫水石蠟包埋，制成4 m厚的切片。    下丘腦：斷頭，迅速摘取下丘腦，稱重后置入液氮內(nèi)，后轉(zhuǎn)入-70冰箱內(nèi)凍存。    血清CORT，血漿ACTH和下丘腦CRH均采用放射免疫分析法檢測，實驗過程參照試劑盒說明書進行。   

10、 肺組織GCR表達按丹麥 Dako公司免疫組化試劑盒Envision系統(tǒng)操作說明進行，每組隨機選取6張切片，用高清晰度圖文分析系統(tǒng)分析GCR陽性細胞的平均總面積（average general area）和平均光密度（average OD）值，每張切片取2個視野，計算平均值。1.6   統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，相關(guān)分析采用線性回歸法，所有資料的統(tǒng)計分析均采用SPSS 11.0 for Windows軟件包完成。2  結(jié)果2.1  各組大鼠血清CORT，血漿ACTH和下丘腦CRH水平的比較結(jié)果見表1。

11、表1  培本方拆方對大鼠血清CORT（略）    結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組血清CORT和血漿ACTH含量顯著降低（P<0.01或P<0.05），下丘腦CRH含量無明顯改變；與模型對照組比較，各給藥組均可以顯著升高CORT含量，可明顯升高ACTH含量的是培本方全方組和培本方拆方組（P<0.01），明顯升高CRH含量的是培本方拆方組（P<0.05）；與阿斯美組比較，CORT含量明顯升高的是培本方全方組和拆方組（P<0.05），影響ACTH含量有統(tǒng)計學意義的是培本方拆方組（P<0.05）。 2.2 

12、各組大鼠肺組織GCR表達的比較結(jié)果見表2。表2  培本方拆方對大鼠肺組織GCR表達的影響（略）    結(jié)果顯示，GCR陽性細胞可表達于肺內(nèi)各級支氣管，幾乎所有的類型的細胞都可以表達，免疫反應主要定位于胞漿及胞核內(nèi)（見圖16）。由表2可以看出，與正常對照組比較，模型對照組GCR陽性細胞的平均面積及平均光密度均明顯降低（均為P<0.01）；與模型對照組比較，培本方全方組及拆方組能明顯升高GCR陽性細胞的平均面積（分別為P<0.01,P<0.05），培本方全方組及培本方拆方，組能明顯升高平均光密度值（分別為P<0.01，P<0.0

13、5，P<0.05），阿斯美組無顯著影響。2.3  培本方影響哮喘大鼠CORT作用的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，培本方通過影響內(nèi)源性GC而發(fā)揮防治哮喘的作用與ACTH和GR有一定的相關(guān)性。表3   培本方影響哮喘大鼠CORT作用的相關(guān)分析（略）3  討 論    有不少臨床及實驗研究表明，哮喘存在下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸不同程度的抑制現(xiàn)象13，體內(nèi)GC濃度不足，使哮喘炎癥反應加重并增加過敏性哮喘的易感性，也許這是哮喘長期反復發(fā)作的機理之一。 GC在體內(nèi)發(fā)揮作用依賴于與細胞內(nèi)GCR的結(jié)合，GCR是決定靶細胞對GC反應

14、性的關(guān)鍵因素之一。GCR缺陷在哮喘發(fā)病機制中具有重要意義4，可能是導致哮喘發(fā)展、炎癥遷延的重要原因。有研究表明，哮喘患者腎上腺皮質(zhì)功能尚未受到明顯損害，其GCR功能即存在異常5。    目前用于治療哮喘的藥物以局部治療作用為主，亟待加強整體調(diào)節(jié)藥物的研發(fā)和應用。以平補氣血陰陽立法的培本方，由黃芪、當歸、女貞子、淫羊藿等藥組成，扶正固本，長于對機體的整體調(diào)節(jié)。曾通過大鼠同種被動皮膚過敏實驗、急性小鼠耳腫脹實驗、福氏完全佐劑小鼠氣囊法等實驗，證實培本方具有良好的抑制炎癥介質(zhì)的釋放、抗炎、抗過敏、調(diào)節(jié)T淋巴細胞的免疫功能等作用6，7，為進一步研究培本方的作用機制奠定了良

15、好的實驗基礎(chǔ)?，F(xiàn)代藥理研究證實方中黃芪能提高血漿皮質(zhì)醇含量，增強腎上腺皮質(zhì)的功能，可通過內(nèi)源性GC發(fā)揮協(xié)同作用，并減少外源性GC的應用所引起的不良反應8；淫羊藿可保護外源性GC對下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸形態(tài)與功能的抑制，對NEI（神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫）網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)起重要的作用9；補陰藥女貞子煎液可促使ACTH（促腎上腺皮質(zhì)激素）的合成與釋放來影響腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞合成與分泌GC10。基于上述的實驗基礎(chǔ)，本實驗旨在通過觀察培本方對哮喘大鼠內(nèi)源性GC各個作用環(huán)節(jié)的影響，探討培本方防治哮喘的作用機制。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)抗原激發(fā)后，哮喘模型組動物CORT和ACTH，GCR水平顯著降低，提示哮喘動物存在內(nèi)

16、源性GC功能缺陷。培本方全方組及拆方，組均能顯著改善哮喘大鼠CORT水平，可明顯升高ACTH含量的是培本方全方組和培本方拆方組，能明顯升高GCR陽性細胞的平均面積和平均光密度值是培本方全方組及拆方組，提示培本方防治哮喘的作用機制與調(diào)節(jié)內(nèi)源性GC有關(guān)，且此作用機制與方中補益陰陽的部分關(guān)系更為明顯。【參考文獻】  1沈自尹，施賽珠，查良倫，等補腎法防治哮喘及其內(nèi)分泌和免疫方面的觀察J.中醫(yī)雜志，1981，22（5）：341.2張海波，羅文侗，劉志民支氣管哮喘患者外周血白細胞糖皮質(zhì)激素受體的改變J.第二軍醫(yī)大學學報，1994，15（4）：310.3童舜華，吳敦序，包照日格圖，等小青龍湯對哮喘大鼠肺組織糖皮質(zhì)激素受體和-受體等水平的影響J.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，1999，5（3）：18.4胡克糖皮質(zhì)激素受體與支氣管哮喘J.國外醫(yī)學?呼吸系統(tǒng)分冊，1994，14（2）：61.5劉輝國，牛汝楫，胡道楨支氣管哮喘患者外周白細胞糖皮質(zhì)激素的受體變化J.中華內(nèi)科雜志，1994，33（3）：150.6郭 忻，毛 平，耿 婭，等培本方抗炎免疫作用的研究J.中成