番荔枝內(nèi)酯對(duì)人淋巴瘤Raji細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響

1、番荔枝內(nèi)酯對(duì)人淋巴瘤Raji細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響         11-05-03 14:38:00     作者：劉昌發(fā),趙永新    編輯：studa20【摘要】  目的 研究番荔枝內(nèi)酯對(duì)體外人淋巴瘤Raji細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法 將體外培養(yǎng)的Raji細(xì)胞分為番荔枝內(nèi)酯組、阿霉素對(duì)照組及未干預(yù)組,番荔枝內(nèi)酯藥物濃度按6.25、12.5、25、50 g/mL分級(jí)作用于細(xì)胞。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法檢測(cè)

2、細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,免疫組化染色檢測(cè)各組細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)的表達(dá)情況。結(jié)果 番荔枝內(nèi)酯組細(xì)胞增殖率均低于未干預(yù)組,25、50 g/mL藥物濃度組細(xì)胞增殖率低于阿霉素組,增殖率與濃度及培育時(shí)間負(fù)相關(guān)；番荔枝內(nèi)酯組細(xì)胞凋亡率高于未干預(yù)組,25、50 g/mL藥物濃度組凋亡率高于阿霉素組,和濃度、時(shí)間正相關(guān)；與未干預(yù)組相比,番荔枝內(nèi)酯組caspase-9表達(dá)量逐步增加,與阿霉素組比較,6.25 g/mL組caspase-9表達(dá)低于阿霉素組(P0.05),50 g/mL濃度組表達(dá)高于阿霉素組(P0.05)。結(jié)論 番荔枝內(nèi)酯對(duì)體外人淋巴瘤Raji細(xì)胞的增

3、殖有抑制作用,并可能通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)其凋亡。 【關(guān)鍵詞】  番荔枝內(nèi)酯；抗腫瘤；凋亡；增殖；caspase-9；Raji細(xì)胞    Abstract：Objective To investigate the effects of annonaceous acetogenin on proliferation and apoptosis in Raji cells and its mechanism. Methods Raji cells cultured in vitro were divided into control group, annonac

4、eous acetogenin group and adriamycin group. Raji cells were effected by 6.25, 12.5, 25, 50 g/mL annonaceous acetogenin. Proliferation of Raji cells were evaluated by MTT assays, apoptosis percentage was assessed by flow cytometry. Caspase-9 protein was detected by immunohistochemistry. Results The R

5、aji cell proliferation rate of annonaceous acetogenin decreased compared with the control, that of 25, 50 g/mL group were lower than adriamycin group, and it was related to the concentration, relying on the incubating time. The apoptosis rate was higher than control, that of 25, 50 g/mL group were h

6、igher than adriamycin group, and it was related to the concentration and the incubating time. The expression of caspase-9 protein of annonaceous acetogenin group was higher than control, and it had a positively relationship with the concentration and incubating time. Conclusions Annonaceous acetogen

7、in could inhibit cell proliferation in a dose-dependent and time-dependent manner in Raji cells, and it may induce Raji cells apoptosis by up-regulating caspase-9 expression.    Key words：annonaceous acetogenin；antitumor；apoptosis；proliferation；caspase-9；Raji cell   

8、60; 番荔枝(Annona squamosa Linn.)為番荔枝科番荔枝屬植物,我國(guó)廣東、廣西、海南、福建、云南等省及臺(tái)灣地區(qū)均有栽培,東南亞、南美國(guó)家及地區(qū)也有廣泛分布。番荔枝內(nèi)酯(annonaceous acetogenins)分布在番荔枝科多種植物的根、樹(shù)皮、種子、葉以及果實(shí)中。研究表明番荔枝內(nèi)酯是一類(lèi)很有希望的新抗癌藥物。筆者研究番荔枝內(nèi)酯在淋巴瘤治療中的應(yīng)用,現(xiàn)將體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。1  實(shí)驗(yàn)材料1.1  藥物    番荔枝內(nèi)酯類(lèi)化合物：為本研究組參照Dos Santos等1方法從番荔枝種子中提取分離所得,為白色蠟狀粉末。使用前

9、以少許無(wú)水乙醇溶解,加生理鹽水配制成所需濃度,乙醇終濃度不超過(guò)1%；鹽酸阿霉素為意大利法瑪西亞公司產(chǎn)品。1.2  主要試劑    四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司),AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 (caspase-9)免疫組化試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。1.3  瘤株    人Burkitts淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫教研室,并由本院實(shí)驗(yàn)室傳代保存。2  實(shí)驗(yàn)方法2.1  分組 &

10、#160;  番荔枝內(nèi)酯組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入生理鹽水溶解的番荔枝內(nèi)酯,實(shí)驗(yàn)終濃度分別為6.25、12.5、25、50 g/mL；未干預(yù)組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的生理鹽水；阿霉素組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入生理鹽水溶解的阿霉素,終濃度為0.1 g/mL。2.2  MTT比色試驗(yàn)    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞1×105/mL,接種于96孔培養(yǎng)板,分別加入不同濃度番荔枝內(nèi)酯以及阿霉素各10 L,孵育24、48、72 h。孵育結(jié)束前4 h,各培養(yǎng)孔加入MTT(5 mg/mL)10 L,離心,棄上清,加入10%二甲基亞砜震蕩溶解結(jié)晶,

11、上酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)492 nm處測(cè)吸光度(OD)值。通過(guò)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞增殖抑制率(%)(未干預(yù)組OD均值實(shí)驗(yàn)組OD均值)/未干預(yù)組OD均值×100%。2.3  實(shí)驗(yàn)步驟    嚴(yán)格按照AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。每份樣品檢測(cè)105個(gè)細(xì)胞,雙參數(shù)結(jié)果以二維散點(diǎn)圖顯示,數(shù)據(jù)由FCM的計(jì)算機(jī)軟件分析輸出。2.4  免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)caspase-9蛋白表達(dá)    將處理組和對(duì)照組細(xì)胞用PBS洗1遍,調(diào)整細(xì)胞濃度1×105/mL,取50 L滴

12、片,無(wú)水丙酮固定20 min,晾干。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行,滴加正常山羊血清,一抗caspase-9兔抗人多克隆抗體,二抗山羊抗兔IgG孵育,滴加辣根酶標(biāo)記工作液,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,中性樹(shù)脂封片。以PBS代替一抗作染色的陰性對(duì)照。結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,在高倍光鏡下至少觀察200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    數(shù)據(jù)為計(jì)量資料。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,多組間比較用方差分析,2組間比較用t檢驗(yàn)；以P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4  結(jié)果4.1  番荔枝內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞caspase-9蛋白表達(dá)的影響    在番荔枝內(nèi)酯組中,隨著藥物濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞中caspase-9蛋白表達(dá)量逐步增加,與未干預(yù)組比較,各組表達(dá)量均高于未干