淋巴細(xì)胞分層液提高上皮細(xì)胞培養(yǎng)效率

1、    淋巴細(xì)胞分層液提高上皮細(xì)胞培養(yǎng)效率        作者單位：香港中文大學(xué)威爾斯親王醫(yī)院矯形外科及創(chuàng)傷學(xué)系【摘要】目的嘗試應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液收集純度高、活性強(qiáng)的上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，探討是否可以加快上皮細(xì)胞培養(yǎng)的速度。方法根據(jù)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞比重上的差異，將經(jīng)過胰酶處理后的小白鼠皮膚，用鑷子把上皮和真皮層撕開，收集兩層之間的基底細(xì)胞，并把這些細(xì)胞懸液加入淋巴細(xì)胞分層液(LP)中，收集中間層的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行體外培養(yǎng)，以傳統(tǒng)方法分離的細(xì)胞培養(yǎng)作為對(duì)照組 。兩組同時(shí)進(jìn)

2、行對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的三種測(cè)試：上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、Lowry蛋白測(cè)定和H+3胸腺嘧啶核甙測(cè)定。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度與對(duì)照組比較有明顯加快的表現(xiàn)。結(jié)論淋巴細(xì)胞分層液能獲得活力強(qiáng)、生長(zhǎng)快的細(xì)胞，可縮短培養(yǎng)成上皮細(xì)胞皮片的時(shí)間，有一定的臨床意義?！娟P(guān)鍵詞】淋巴細(xì)胞分層液上皮細(xì)胞Improving the rate of skin keratinocyte cultureapplication of a lymphocyte isolation fluid Wu HT,Hung LK,Leung PC,et al.The Department of Orthopaedics &a

3、mp; Traumatology,Prince of Wales Hospital,Chinese University of Hong Kong【Abstract】Objective This study was to improve the rate of skin keratinocyte culture by application of a lymphocyte isolation fluid.Methods A lymphocyte isolation fluid“Lymphoprep”contains 5.6%(W/V) of Ficoll,with a density of 1

4、.077g/ml.According to the difference between the densities of keratinocytes(1.065-1.085g/ml) and fibroblasts(1.025-1.050g/ml),the two cell types can be separated by suspension in the solution.We performed a controlled study in new born mice:the epidermis and dermis of skin were separated by forceps

5、after trypsinization.The cell suspension collected was laid over Lymphoprep after centrifugation at 23,8000 g for 10 min.The keratinocytes were collected at the middle-interphase,and these cells were pure and viable keratinocyte cells.Results In subsequent keratinocyte culture we found that the cell

6、 growth was faster than cells obtained from conventional technique.It greatly shortened the preparation time of keratinocyte cell sheet.Conclusion The method will be valuable clinically for treatment of burn patients.【Key words】 Lymphoprep Isolation fluid Epithelium Cell自體植皮是燒傷病人和皮膚潰瘍病人的主要治療方法之一。近年來

7、已有不少報(bào)道應(yīng)用自體皮膚分離出上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，制成上皮細(xì)胞皮片覆蓋于傷口上，以促進(jìn)上皮的生長(zhǎng)和傷口的愈合14。但體外培養(yǎng)的時(shí)間一般都較長(zhǎng)(1623天)，不能及時(shí)應(yīng)用，因此我們嘗試使用Lymphoprep(LP)淋巴細(xì)胞分層液(廠家：Nyegarrd Co,Norway)利用成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞比重的不同，經(jīng)離心后獲得純度高、增殖快的上皮細(xì)胞，加快了制成上皮細(xì)胞皮片的速度5。一般情況下，應(yīng)用LP分離法，每平方厘米的皮膚可收集得到1×106的活上皮細(xì)胞，經(jīng)接種在無3T3纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的75cm+2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)1012天后，即可獲得大約4cm×5cm的上皮細(xì)胞皮片。而應(yīng)用傳統(tǒng)

8、的分離細(xì)胞方法及使用3T3纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層需較長(zhǎng)時(shí)間(預(yù)備3T3飼養(yǎng)細(xì)胞層需35天，培養(yǎng)上皮細(xì)胞需要1318天)。1材料和方法以初生小白鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用LP加強(qiáng)分離上皮細(xì)胞，而對(duì)照組則不使用LP。兩組的細(xì)胞培養(yǎng)均不使用3T3作為飼養(yǎng)細(xì)胞層4。無菌操作下取初生小鼠皮膚，去除脂肪，切成1mm×10mm小塊皮片，放入0.125%胰酶中置4消化過夜。次日取出放入37溫箱30分鐘，然后用小牛血清中止胰酶反應(yīng)。把消化后的皮片放入盛有DMEM營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上，用小鑷子把上皮和真皮撕開，兩層之間的基底細(xì)胞落入DMEM營(yíng)養(yǎng)液中。同時(shí)用毛細(xì)吸管小心吹打上皮底層及真皮上層的細(xì)胞，

9、用銅篩過濾后，收集這些細(xì)胞懸液，用計(jì)算盤數(shù)細(xì)胞總數(shù)和死、活細(xì)胞數(shù)(用臺(tái)盼藍(lán)作染色，藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，不著色者為活細(xì)胞)，作記錄。把同一批的細(xì)胞懸液分成兩等份，分別給對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組使用。對(duì)照組直接把這些細(xì)胞懸液用上皮細(xì)胞培養(yǎng)液(KGM培養(yǎng)液)稀釋成0.5×106細(xì)胞/ml，接種于24孔的培養(yǎng)板上，置37溫箱培養(yǎng)，而實(shí)驗(yàn)組則先用毛細(xì)吸管把細(xì)胞懸液輕輕置于等量的LP之上，經(jīng)2000r/min離心10分鐘后，小心吸取中間的細(xì)胞層，用DMEM營(yíng)養(yǎng)液洗一次，然后數(shù)細(xì)胞總數(shù)及死、活細(xì)胞數(shù)，并用KMG培養(yǎng)液稀釋成0.5×106細(xì)胞/ml接種于24孔培養(yǎng)板上，置37溫箱培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程

10、中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)作以下三種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的測(cè)試。1.1上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組接種的細(xì)胞數(shù)相同(0.5×106細(xì)胞/孔)、培養(yǎng)液相同，每周換液3次。分別在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日、及實(shí)驗(yàn)后第1，2，4，7，9，11，13，15，17，20，22日抽檢一組，先吸出培養(yǎng)液，加胰酶消化數(shù)分鐘。吸出消化液再把原培養(yǎng)液倒回，用吸管吹打培養(yǎng)孔底部細(xì)胞制成懸液，計(jì)算出每毫升細(xì)胞數(shù)，及死活細(xì)胞比例，繪制曲線。1.2Lowry蛋白測(cè)定測(cè)試日期與測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相同，先配制不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄去培養(yǎng)孔內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液，用0.15mol/L NaCl洗3次。然后加入0.25mol/L NaOH

11、置室溫30分鐘，移入試管內(nèi)，再加等量0.25mol/L HCl中和。加入Lowry試劑搖勻后置室溫20分鐘。加入酚紅試劑搖勻，置室溫30分鐘，用紫外線光譜儀在750nm光段測(cè)讀數(shù)，繪制曲線。1.3H+3-胸腺嘧啶核甙測(cè)定利用同位素H+3標(biāo)記胸腺嘧啶核甙的測(cè)定，可作為DNA合成物的檢測(cè)量度上皮細(xì)胞增殖的活力6。測(cè)試日期與生長(zhǎng)曲線測(cè)定及蛋白測(cè)定相同。配制并加入H+3標(biāo)記胸腺嘧啶核甙DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)孔內(nèi)，置37含5%CO-2的溫箱內(nèi)4小時(shí)，棄去培養(yǎng)孔內(nèi)液體并用0.15mol/L NaCl洗1次。加入0.25mol/L NaOH置溫室20分鐘以溶解細(xì)胞，并移入試管內(nèi)。用等量的0.25mol/L H

12、Cl中和反應(yīng)，加入含有BSA的Hepes-Mg-Ca試劑和10N PCA，放置-20冰箱過夜，次日放420分鐘。用12000r/min低溫離心沉淀30分鐘，棄去上清液，用0.25mol/L NaOH溶解沉淀物。移入測(cè)試管內(nèi)，加入閃爍液并在閃爍測(cè)量?jī)x內(nèi)測(cè)試讀數(shù)。所得數(shù)據(jù)均按雙因素方差分析法，t檢驗(yàn)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。實(shí)驗(yàn)組用LP分離法每平方厘米皮膚所得細(xì)胞總數(shù)為98×104，其中活細(xì)胞數(shù)92.86×104。而對(duì)照組分離所得細(xì)胞總數(shù)為397×104，其中活細(xì)胞數(shù)328×104。雖然實(shí)驗(yàn)組分離所得的細(xì)胞總數(shù)少于對(duì)照組，但活細(xì)胞比

13、率卻明顯高于對(duì)照組，t檢驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組(94.7171±1.4610)對(duì)照組(82.6097±2.4937)差異有非常顯著意義(P<0.001)。2.2以相同的活細(xì)胞濃度(50×104細(xì)胞/孔)接種培養(yǎng)24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組已有44.7×104的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而對(duì)照組只有21×104細(xì)胞貼壁。t檢驗(yàn)活細(xì)胞比率分別為89.4592±2.9550與42.5292±3.8170，差異有非常顯著意義(P<0.001)。2.3在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞已長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底部(1)，而對(duì)照組的細(xì)胞只長(zhǎng)成細(xì)胞集落(2)，直至在第13天

14、才長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底部。2.4上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(3)和Lowry蛋白測(cè)定(4)均顯示實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞接種24小時(shí)后便迅速增殖，直至第9天開始減慢。而對(duì)照組在接種7天后才開始迅速增殖，第15天速度減慢，組間比較，從接種后第113天實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相點(diǎn)顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。H+3-胸腺嘧啶核甙測(cè)定(5)顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在接種后細(xì)胞增殖的活力不斷上升，第7天到最高峰，7天后開始減弱，組間比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相點(diǎn)亦顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。+2=161.4545， P<0.00013上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig 3 Epidermal cell growth curue+2=138.48

15、03，P<0.00014Lowry蛋白測(cè)定Fig 4 Lowry protein assay+2=131.5786，P<0.00015H3-胸腺嘧啶核甙測(cè)定Fig 5 H+3-Thymidine assay3討論實(shí)驗(yàn)證明用LP能分離出高純度高活力的上皮細(xì)胞。這些細(xì)胞在培養(yǎng)后第4天便長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底部。而對(duì)照組接種的細(xì)胞由于混有其他細(xì)胞成份，例如組織碎片，無增殖能力的角化上皮細(xì)胞、少量的纖維細(xì)胞等。這些細(xì)胞的代謝產(chǎn)物及所占據(jù)的空間，影響了有增殖能力的上皮細(xì)胞的貼壁和繁殖，以至在接種后最初幾天新增殖的細(xì)胞數(shù)目和死亡的細(xì)胞數(shù)目幾乎相等。H+3-標(biāo)記胸腺嘧啶核甙測(cè)定顯示上皮細(xì)胞增殖活力最強(qiáng)是在

16、細(xì)胞培養(yǎng)的初期，第7天達(dá)最高峰，7天后開始減弱。實(shí)驗(yàn)組由于在第4天已經(jīng)長(zhǎng)滿一層細(xì)胞，到細(xì)胞活力最高的第7天已經(jīng)長(zhǎng)成超過一層的細(xì)胞層。而對(duì)照組由于在第7天才開始有機(jī)會(huì)迅速繁殖，其活力已開始減弱，所以在第13天才長(zhǎng)滿一層。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明用LP分離上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，大大縮短了制成上皮細(xì)胞皮片的時(shí)間，在臨床應(yīng)用上具有一定意義。但是由于用LP分離上皮細(xì)胞過程中會(huì)失去較多量的細(xì)胞，因此在技術(shù)上有待進(jìn)一步改進(jìn)。(本文1，2見插頁第6頁)淋巴細(xì)胞分層液提高上皮細(xì)胞培養(yǎng)效率1實(shí)驗(yàn)組：皮膚上皮細(xì)胞培養(yǎng)第4天，上皮細(xì)胞之間互相融合成片2對(duì)照組：皮膚上皮細(xì)胞培養(yǎng)第4天可見上皮細(xì)胞集落并有上皮細(xì)胞橫跨細(xì)胞集落之間Fi

17、g1 Skin keratinocyte culture at day 4 after plating in test group, The picture shows that the epithelial cells were confluenct Fig2 Skin keratinocyte culture at day 4 after plating in control group,The picture shows that there are only some epithelial cell colonies and some cell processes across col

18、ony參考文獻(xiàn)1Liu S，Karasek M.Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.J Invest Dermatol,1978,71:157-162.2Karasek M,Charltom M.Growth of postembryonic skin epithelial cells on collagen gels.J Invest Dermatol,1971,56:205-210.3Freeman A,Igel H,Herrman B,et al.Growth and characterization of human skin epithelial cell cultures.In Vitro,1976,12:352-362.4