淺論VEGF單克隆抗體對(duì)胰腺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響

1、淺論VEGF單克隆抗體對(duì)胰腺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響                  作者：楊家紅 謝嶸 王瑩 范昕【摘要】  目的： 從胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的角度探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）單克隆抗體在胰腺缺血再灌注損傷中保護(hù)作用。方法： 采用鉗閉大鼠腹腔干、腸系膜上動(dòng)脈制備胰腺缺血再灌注損傷模型，并應(yīng)用細(xì)胞凋亡原位標(biāo)記法(TUNEL)、免疫組化技術(shù)等檢測(cè)VEGF單克隆抗體干預(yù)后對(duì)胰腺細(xì)胞凋亡及Bax,Bcl2蛋白表

2、達(dá)的影響。結(jié)果： 干預(yù)組15，30，60 min胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于缺血再灌注組(P0.01)。正常胰腺組織未見凋亡調(diào)控基因Bcl2的表達(dá), VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bcl2染色陽(yáng)性率明顯高于缺血再灌注組(P0.01)；正常胰腺組織見較弱的凋亡調(diào)控基因Bax的表達(dá)，而VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bax染色陽(yáng)性率明顯低于缺血再灌注組(P0.01)。結(jié)論： VEGF單克隆抗體能夠通過(guò)抑制胰腺腺泡細(xì)胞的過(guò)度凋亡減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度，該作用可能是通過(guò)促進(jìn)抗凋亡Bcl2基因表達(dá)，抑制促進(jìn)凋亡基因Bax表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】 

3、胰腺； 缺血再灌注； 細(xì)胞凋亡； VEGF單克隆抗體； Bax； Bcl2   Abstract  Objective: To investigate the effect of VEGF McAb  protecting on pancreas injury during experimental ischemic/reperfusion in rats.Methods： Ischemic/reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and th

4、e celica artery of 70 rats.Apoptosis of pancreatic acinar cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiot in nick end labeling(TUNEL) method, and the expression of apoptosis regulated gene Bax and Bcl2 was detected by immunohistochemical technique. Results： The index of

5、 apoptosis increased significantly in pancreatic tissues after pancreatic ischemia/reperfusion injury but  offset by administration of VEGF McAb.Immunohistochemical analysis showed that just weak Bax staining cells were detected, with no Bcl2 positive staining cells in normal pancreatic tissues

6、.The positive rate of Bcl2 protein in VEGF McAb group was significantly higher than ischemic/reperfusion group while the positive rate of Bax was significantly lower(all P0.01). Conclusion： VEGF McAb treatment alleviated pancreatic ischemia/reperfusion injury by restraining excessive apoptosis.This

7、effect might be related with upregulating the expression of Bcl2 and downregulating the expression of Bax.   Key words  pancrease;   ischemic/reperfusion;   apoptosis;   VEGF McAb;   Bax;   Bcl2   缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I

8、/R)損傷是一種常見的臨床病理生理過(guò)程，在急性胰腺炎(AP)的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系1，現(xiàn)已證實(shí)，AP大鼠的發(fā)病過(guò)程中胰腺存在細(xì)胞凋亡的改變，且與其病變的嚴(yán)重程度有關(guān)2。本實(shí)驗(yàn)旨在探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體在I/R損傷后對(duì)胰腺細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制，以探討AP治療的新途徑。   1  材料與方法   1.1  動(dòng)物及主要試劑   清潔級(jí)SD大鼠共70只，雌雄不限（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），VEGF單克隆抗體（Santa Cruz 公司

9、），鼠抗Bcl2單克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）、兔抗Bax單克隆抗體（Santa Cruz公司），鏈霉素親生物素過(guò)氧化物酶標(biāo)(SP)免疫組化試劑盒(Biotech公司產(chǎn)品)。   1.2  方  法   1.2.1  動(dòng)物分組  成年Wistar大鼠70只，隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)、缺血再灌注損傷組(30只)和VEGF單抗干預(yù)組(30只)，其中缺血再灌注損傷組和VEGF單抗干預(yù)組再分為15，30，60 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，每組10只。   1.2.2  動(dòng)物模型制作 

10、; 術(shù)前12 h禁食不禁水， 0.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切開，找到腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈。對(duì)照組不用血管鋏鉗閉腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈，直接取胰腺組織標(biāo)本，心臟穿刺取血2 ml；缺血再灌注損傷組和VEGF單克隆抗體干預(yù)組分別以血管夾阻斷腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈15，30，60 min(各10只)后再灌注6 h，取胰腺組織標(biāo)本。   1.2.3  干預(yù)及處理  VEGF單克隆抗體干預(yù)組于術(shù)前5 min 尾靜脈注射VEGF單克隆抗體100  g/300 g，缺血再灌注損傷組僅注射等量生理鹽水。   1.3

11、60; 胰腺組織的檢測(cè)   1.3.1  胰腺細(xì)胞凋亡的檢測(cè)  按Boenger Manheim公司試劑盒說(shuō)明操作，光鏡下觀察計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)計(jì)算方法:數(shù)4個(gè)高倍視野，分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%   1.3.2  免疫組化SP法檢測(cè)胰腺組織細(xì)胞凋亡基因  胰腺組織常規(guī)石蠟切片， 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，胰蛋白酶液消化，室溫20 min。以下步驟按SP試劑盒說(shuō)明操作， 光鏡下計(jì)算胰腺細(xì)胞Bax,Bcl2染色陽(yáng)性率。結(jié)果判

12、斷: 細(xì)胞染色呈棕褐色或棕黃色為陽(yáng)性，Bax,Bcl2免疫陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核。胰腺細(xì)胞染色陽(yáng)性率計(jì)算方法: 數(shù)4個(gè)高倍視野， 分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)， 陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。   1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理   用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件行方差齊性檢驗(yàn)、方差分析、t檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)， P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。            2  結(jié)  果   2.1  胰腺

13、細(xì)胞的凋亡情況   對(duì)照組中有少量腺泡細(xì)胞的凋亡，且組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)凋亡指數(shù)相當(dāng)。缺血再灌注組及VEGF單抗干預(yù)組的凋亡指數(shù)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸加重，均明顯高于對(duì)照組(P0.01)。VEGF單抗干預(yù)組凋亡指數(shù)均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)缺血再灌注組(P0.01)。見表1。   2.2  胰腺腺泡細(xì)胞Bax 表達(dá)的變化   正常胰腺組織見較弱的凋亡調(diào)控基因Bax的表達(dá)，而VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bax 染色陽(yáng)性率明顯低于缺血再灌注組（P0.01）。見表2。表1  各組凋亡指數(shù)的比較表2 

14、; 各組凋亡調(diào)控基因Bax,Bcl2 染色陽(yáng)性率比較a:與缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)比較, P0.01   正常胰腺組織未見有Bcl2 表達(dá)，VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bcl2染色陽(yáng)性率明顯高于缺血再灌注組(P0.01)。   3  討  論   目前認(rèn)為， I/R 是胰腺炎、尤其是胰腺移植后胰腺炎的重要原因3，而VEGF可能是其加重因素。其原因可能為VEGF參與了在I/R中白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用；同時(shí)有研究表明VEGF本身能增加血管通透性增加，降低功能性血管密度，加重缺血損傷4。再灌注

15、期，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)與氧自由基、細(xì)胞因子等相互作用、互為因果，形成瀑布樣效應(yīng)，造成微循環(huán)紊亂，從而使胰腺損傷進(jìn)一步加劇5。應(yīng)用VEGF單克隆抗體后，能夠減輕起始階段的炎癥因子與白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，減輕瀑布樣反應(yīng)。   目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡由兩條通路調(diào)節(jié)：細(xì)胞表面死亡受體通路和線粒體通路，這兩條通路都參與了胰腺缺血再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡，比較受重視的是凋亡發(fā)生的線粒體途徑。在線粒體途徑中，Bcl2家族蛋白在其中起重要作用。本研究選擇的兩個(gè)基因Bax 和Bcl2是凋亡調(diào)控基因Bcl2家族成員之一，Bax可形成同源二聚體BaxBax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生;而當(dāng)Bc

16、l2存在時(shí)，Bcl2可以與Bax形成比BaxBax二聚體更穩(wěn)定的BaxBcl2異源二聚體，從而中和BaxBax二聚體的促凋亡作用。因此Bcl2/Bax的比例可決定細(xì)胞的命運(yùn)，其比例增高，細(xì)胞不易發(fā)生凋亡，比例降低則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax過(guò)度表達(dá)時(shí)可抑制Bcl2功能而促進(jìn)細(xì)胞凋亡6，Bcl2，Bax二者作用相互拮抗7。在我們?cè)缙谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1受體拮抗劑可以通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2，Bax表達(dá)胰減輕腺炎的嚴(yán)重程度8。本實(shí)驗(yàn)顯示在正常胰腺組織未見凋亡調(diào)控基因Bcl2表達(dá)而Bax弱表達(dá)。VEGF單抗干預(yù)組及缺血再灌注組15，30，60 min的胰腺細(xì)胞Bax染色陽(yáng)性率高于對(duì)照組，VEGF單抗干預(yù)組Ba

17、x染色陽(yáng)性率明顯低于缺血再灌注組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)；VEGF單抗干預(yù)組胰腺細(xì)胞Bcl2 染色陽(yáng)性率明顯高于缺血再灌注組15，30，60 min染色陽(yáng)性率(P均0.01)。   在胰腺缺血再灌注損傷早期便可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，這可能是胰腺缺血再灌注損傷早期的主要表現(xiàn)。過(guò)多的細(xì)胞凋亡超過(guò)組織自身的清除能力，凋亡的細(xì)胞會(huì)向壞死轉(zhuǎn)化，反而會(huì)加重再灌注后的炎癥反應(yīng)，故胰腺出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞不利于胰腺功能的恢復(fù)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們推測(cè)VEGF單克隆抗體可能通過(guò)上調(diào)抑制凋亡基因Bcl2的表達(dá)，抑制促凋亡基因Bax表達(dá)來(lái)抑制缺血再灌注過(guò)程的細(xì)胞過(guò)度凋亡，保護(hù)胰腺細(xì)胞。【參考文獻(xiàn)】  1 Fujimo

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