抗HBsAg人源抗體Fab片段原核表達(dá)的優(yōu)化

1、抗HBsAg人源抗體Fab片段原核表達(dá)的優(yōu)化               作者：焦永軍, 曾曉燕, 史智揚(yáng), 汪華, 崔侖標(biāo), 龔希萍, 薛蓉, 周鎮(zhèn)先 【摘要】  目的: 優(yōu)化抗HBsAg人源抗體片段hFabHB1在大腸桿菌中功能性表達(dá)的條件。方法: 通過測定宿主菌培養(yǎng)物A600值觀察10 g/L的葡萄糖對(duì)宿主菌生長的影響; 比較誘導(dǎo)前是否更換培養(yǎng)液的2種不同條件hFabHB1的表達(dá)產(chǎn)量; 比較在37和25 2種誘導(dǎo)溫度下功能性hFa

2、bHB1分子的表達(dá)量以及Fd和輕鏈表達(dá)的平衡性。大量表達(dá)的功能性hFabHB1分子經(jīng)親和層析純化后, 用ELISA鑒定其生物活性。結(jié)果: 在培養(yǎng)液中加入10 g/L的葡萄糖可有效抑制重組蛋白的本底表達(dá), 增加宿主菌的生長速度; 在加入IPTG誘導(dǎo)前更換培養(yǎng)液可明顯提高h(yuǎn)FabHB1的表達(dá)產(chǎn)量; 25的誘導(dǎo)溫度比37能表達(dá)更多的功能性Fab分子, 并且Fd和輕鏈表達(dá)量也更趨于平衡。經(jīng)親和層析純化的hFabHB1分子可與HBsAg特異性結(jié)合。結(jié)論: 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)該抗體片段提供了技術(shù)儲(chǔ)備。 【關(guān)鍵詞】  抗HBsAg人源抗體 hFabHB1 原核表達(dá) 優(yōu)化 乙型病毒性肝炎

3、（簡稱乙肝）是一類嚴(yán)重危害人體健康的感染性疾病, 全球約有3.5億人感染乙肝病毒（HBV）, 其中近10%的患者可因持續(xù)感染導(dǎo)致肝硬化或肝細(xì)胞癌1。針對(duì)HBsAg的中和抗體可阻斷乙肝病毒對(duì)肝細(xì)胞的吸附, 從而避免了病毒攻擊。目前HBsAg 的中和抗體作為免疫治療劑已在臨床上廣泛使用, 如對(duì)HBsAg陽性產(chǎn)婦生產(chǎn)的新生兒進(jìn)行抗體的被動(dòng)免疫, 以阻斷母嬰垂直傳播2; 對(duì)肝移植的乙肝患者進(jìn)行抗體的緊急接種來保護(hù)移植肝組織免受病毒感染等3。但目前使用的抗體均來自人血清, 價(jià)格貴, 來源有限, 且存在其他病原體感染的潛在威脅2。hFabHB1是通過基因工程技術(shù), 從HBV免疫型噬菌體抗體文庫中篩選的全人

4、源Fab型抗體片段分子, 其靶分子是HBV HBsAg, 實(shí)驗(yàn)證實(shí)hFabHB1可有效阻止HBV與人原代肝細(xì)胞的結(jié)合, 是一個(gè)具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的候選分子。但hFabHB1在原核表達(dá)系統(tǒng)中存在問題, 主要表現(xiàn)在, 組成Fab分子的重鏈Fd段和輕鏈大多只能以包涵體形式表達(dá), 形成有功能的Fab異二聚體分子較少, 并且Fd和輕鏈表達(dá)量失衡, 輕鏈大于Fd。本研究對(duì)影響hFabHB1功能性表達(dá)的各類因素進(jìn)行優(yōu)化, 如抑制宿主細(xì)菌的本底表達(dá)、 在誘導(dǎo)前更換培養(yǎng)液、 降低誘導(dǎo)溫度等,    使其最終表達(dá)產(chǎn)量達(dá)到20 mg/L。 1  材料和方法 1.1 

5、; 材料  重組質(zhì)粒pComb3x?hFabHB1為從噬菌體抗體庫中篩出的、 能特異性與HBsAg結(jié)合的抗體克隆; 大腸桿菌表達(dá)菌株Top10F購自Invitrogen公司; Protein L柱填料購自Pierce公司, HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG（Fab 特異性）抗體購自Sigma公司; HBsAg由深圳康泰股份有限公司贈(zèng)送。    1.2  方法 1.2.1  葡萄糖對(duì)宿主細(xì)菌生長的影響  重組質(zhì)粒pComb3x?hFabHB1轉(zhuǎn)化Top10F化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞, 挑單菌落置10 mL LB培養(yǎng)液（含100 mg

6、/L氨芐青霉素, AmpR） 37 250 r/min培養(yǎng)過夜。次日用50 mL LB培養(yǎng)液（100 mg/L AmpR） 1100稀釋過夜培養(yǎng)物, 平均分成A、 B2份, 在A中加入終濃度為10 g/L的葡萄糖, B中不加。A、 B2份同時(shí)在37、 250 r/min培養(yǎng), 每2 h測A600值, 共培養(yǎng)8 h。 1.2.2  誘導(dǎo)前更換培養(yǎng)液對(duì)表達(dá)產(chǎn)量的影響  用50 mL LB培養(yǎng)液（含有100 mg/L AmpR和10 g/L的葡萄糖） 1100稀釋過夜培養(yǎng)物, 平均分成A、 B 2份, 37培養(yǎng)約6 h至A600值=1.0, 對(duì)A, 1500 g離心10 min,

7、 然后用同等體積的新鮮LB培養(yǎng)液（含有100 mg/L AmpR）重懸, 對(duì)B不做處理。在A、 B中同時(shí)分別加入終濃度為1 mmol/L的IPTG, 37誘導(dǎo)3 h。取80 L培養(yǎng)物, 加入20 L5×還原型loading buffer, 100煮沸10 min。樣品經(jīng)瞬時(shí)離心后, 每個(gè)樣品上樣5 L行Western blot, 抗體用HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG（Fab 特異性）, 比較表達(dá)量。 1.2.3  溫度對(duì)hFabHB1分子功能性表達(dá)的影響  用50 mL LB培養(yǎng)液（含有100 mg/L AmpR和10 g/L的葡萄糖） 1100稀釋過夜培養(yǎng)物, 37

8、培養(yǎng)約6 h至A600值=1.0, 更換培養(yǎng)液, 加入終濃度為1 mmol/L的IPTG, 平均分成A、 B2份,    它們分別在37和25誘導(dǎo)12 h。取1 mL培養(yǎng)物, 10000 g離心2 min, 取80 L表達(dá)上清, 加入20 L5×非還原型loading buffer, 混勻, 不煮沸。另取80 L表達(dá)上清, 加入20 L 5×還原型loading buffer, 混勻, 100煮沸10 min。每個(gè)樣品上樣5 L行Western blot, 抗體用HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG（Fab 特異性）, 比較重、 輕鏈表達(dá)均衡性和功能性h

9、FabHB1表達(dá)量。 1.2.4  親和層析大量純化功能性hFabHB1蛋白  用1000mL LB培養(yǎng)液（含有100 mg/L AmpR和10 g/L的葡萄糖） 1100稀釋過夜培養(yǎng)物, 37培養(yǎng)約6 h至A600值=1.0, 更換培養(yǎng)液, 加入終濃度為1 mmol/L的IPTG, 25誘導(dǎo)過夜。5000 g離心20 min, 分別收集上清和沉淀。調(diào)節(jié)上清液pH至7.0, 過0.45 mol/L的微孔濾膜; 對(duì)于存在于細(xì)菌質(zhì)周腔（periplasmic space）中功能性蛋白, 則在表達(dá)沉淀中加入原培養(yǎng)體積50 g/L的蔗糖高滲緩沖液（50 mmol/L Tris?HC

10、l, 200 g/L蔗糖, 1 mmol/L EDTA, pH8.0）4, 置冰上1 h, 輕微震蕩, 30000 g離心30 min, 收集上清液, 與表達(dá)上清混合。用Protein L親和層析柱進(jìn)行純化, 計(jì)算表達(dá)產(chǎn)量。純化的hFabHB1分子分別在還原和非還原條件下電泳。    1.2.5  hFabHB1蛋白的活性測定  采用ELISA方法。將HBsAg稀釋至10 mg/L 4包被過夜（100 L/孔）, 50 g/L脫脂奶粉封閉液4封閉過夜, 加入hFabHB1抗體分子（純化的hFabHB1分子1500稀釋, 濃度為1 mg

11、/L, 100 L/孔）, 同時(shí)用乙肝陽性血清和正常人血清（11000稀釋）分別作陽性、陰性參考, 于37孵育2 h, 充分洗滌后, 加入HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG（Fab特異性）, 37孵育1 h, 充分洗滌后, 加底物室溫顯色30 min, 加入2 mol/L H2SO450 L/孔終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上以空白孔調(diào)零, 讀A450值。 2  結(jié)果 2.1  宿主細(xì)菌生長條件的優(yōu)化  在宿主菌的培養(yǎng)物中加入終濃度為10 g/L的葡萄糖可明顯促進(jìn)細(xì)菌的生長速度, 其A600值可在6.5 h內(nèi)升至1.0, 而未加葡萄糖的對(duì)照組在8 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)其A600值只有0.2

12、5（圖1）。重組蛋白的表達(dá)是建立在一定數(shù)量細(xì)菌的基礎(chǔ)之上的, 在誘導(dǎo)前, 必須盡可能抑制宿主菌的本底表達(dá), 加快其分裂速度。 圖1  葡萄糖對(duì)宿主細(xì)菌生長的影響（略） 2.2  更換培養(yǎng)基對(duì)hFabHB1表達(dá)產(chǎn)量的影響  在加入IPTG誘導(dǎo)之前, 更換表達(dá)培養(yǎng)液可明顯提高重組抗體hFabHB1的產(chǎn)量（圖2）, 但此處通過Western blot檢測的hFabHB1包括可溶性表達(dá)和包涵體表達(dá)兩部分,  包涵體的功能復(fù)性存在困難, 并且組成Fab分子的Fd和輕鏈的表達(dá)失衡問題依然存在。 圖2  Wester blot分析在誘導(dǎo)前更換培養(yǎng)液對(duì)表達(dá)產(chǎn)量

13、的影響（略） 1: IPTG誘導(dǎo)前更換培養(yǎng)液hFabHB1的表達(dá); 2: IPTG誘導(dǎo)前不更換培養(yǎng)液hFabHB1的表達(dá). 2.3  溫度對(duì)hFabHB1分子功能性表達(dá)的影響  隨著表達(dá)時(shí)間的延長, Fab分子可分泌至培養(yǎng)上清液中, 但在不同的誘導(dǎo)溫度下, 功能性Fab分子的含量存在著具大的差別, 25誘導(dǎo)條件下的分泌量明顯大于37的量, 并且在25條件下, Fd和輕鏈的表達(dá)量更趨于平衡（圖3）。雖然在37比25的誘導(dǎo)下菌體能表達(dá)更多的蛋白, 但可能都以不溶的包涵體形式存在, 分泌到外面上清中的蛋白極少。圖3  不同溫度下功能性hFabHB1表達(dá)產(chǎn)量的比較（略）

14、1, 3: 25誘導(dǎo)條件下hFabHB1的表達(dá)（分別在非還原和還原條件下）; 2, 4: 37誘導(dǎo)條件下hFabHB1的表達(dá)（分別在非還原和還原條件下）. 2.4  親和層析大量純化功能性hFabHB1蛋白  表達(dá)上清中的重組蛋白經(jīng)調(diào)節(jié)pH和離心處理后可直接進(jìn)行親和層析純化, 對(duì)于存在于細(xì)胞質(zhì)周腔的Fab, 通過在表達(dá)菌體沉淀中加入蔗糖滲出緩沖液促使蛋白溢出, 從而減少了超聲波碎菌帶來的雜蛋白污染。重組蛋白經(jīng)Protein L親和層析柱純化后, 其最終產(chǎn)量為20 mg/L。在還原型SDS?PAGE上hFabHB1分子的二硫鍵斷裂后可分為Fd和輕鏈兩條帶; 而在非還原型SDS

15、?PAGE上hFabHB1分子則表現(xiàn)為一條帶, Mr約為50000 (圖4)。    圖4  SDS?PAGE檢測純化的hFabHB1蛋白（略） 1: 蛋白marker; 2: 還原條件下純化的hFabHB1; 3: 非還原條件下純化的hFabHB1. 2.5  ELISA測定hFabHB1蛋白活性  與乙肝陽性血清及正常人血清（A450值分別為1.30和0.14）相比, hFabHB1的A450值為0.90, 說明其能與HBsAg有很好的結(jié)合。 3  討論    乙肝治療性抗體在臨床

16、上的用量很大, 與其他治療用重組蛋白類似, 表達(dá)產(chǎn)量往往成為瓶頸問題5。影響hFabHB1分子在大腸桿菌中的成功表達(dá)主要取決于轉(zhuǎn)錄和翻譯2個(gè)方面的因素。本研究中, 使用的表達(dá)載體pComb3xss6為氨芐抗性（含bla基因）, 負(fù)責(zé)外源基因轉(zhuǎn)錄的為乳糖啟動(dòng)子（lacUV5）, 在設(shè)計(jì)上為雙順反子結(jié)構(gòu)（dicistronic expression cassette）, 編碼輕鏈的基因在前, Fd基因在后, 擁有2個(gè)翻譯起始位點(diǎn)。在IPTG的誘導(dǎo)下外源基因開始轉(zhuǎn)錄、 表達(dá)。但lac操縱子存在明顯的“滲漏”現(xiàn)象, 在無IPTG情況下亦有外原基因本底表達(dá), 這不利于細(xì)菌的生長。而葡萄糖通過對(duì)lac操縱

17、子的阻遏作用能抑制目的蛋白的表達(dá)7。同時(shí), 人源Fab分子對(duì)于宿主細(xì)菌來說為異源蛋白, 可能存在一定的毒性, Fab的本底表達(dá)降低了其分裂的速度, 加入葡萄糖可明顯提高其生長狀況。重組細(xì)菌在培養(yǎng)過程分泌大量的?內(nèi)酰胺酶, 可降解培養(yǎng)液中氨芐青霉素; 同時(shí), 細(xì)菌在培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生酸性物質(zhì), 降低培養(yǎng)基的pH值, 而氨芐青霉素在低pH值條件下極易水解8。這就意味著隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長, 失去重組質(zhì)粒的細(xì)菌由于沒有氨芐青霉素的監(jiān)控而快速分裂, 其密度逐漸超過重組菌體而使得最終重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量下降。而在加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)之前更換培養(yǎng)液, 一方面可去除培養(yǎng)液中?內(nèi)酰胺酶和調(diào)節(jié)pH值, 另外可把氨芐青

18、霉素的濃度恢復(fù)到可監(jiān)控的水平, 及時(shí)殺死突變的菌株, 從而提高重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。組成Fab的Fd和輕鏈分子分別在胞質(zhì)表達(dá), 通過各自的信號(hào)肽引導(dǎo)運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)周腔中, 該腔為氧化的環(huán)境, 并可提供蛋白二硫鍵異構(gòu)酶等多種伴侶分子, 利于Fd和輕鏈分子鏈內(nèi)、 鏈間二硫鍵的形成9。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長, Fab可透過質(zhì)周腔外壁多孔的膜結(jié)構(gòu)溢到外界環(huán)境中10。因此, 可以通過檢測表達(dá)上清中功能性Fab分子的含量, 即可推斷其在質(zhì)周腔中的表達(dá)水平。在高溫條件下（如37）抗體重、 輕鏈表達(dá)的產(chǎn)量增加, 但多易在胞質(zhì)內(nèi)形成不溶、 無活性的包涵體, 給下游的蛋白復(fù)性工作帶來困難。低溫雖然導(dǎo)致表達(dá)強(qiáng)度下降, 但新生的

19、多肽分子可充分應(yīng)用宿主菌提供的轉(zhuǎn)運(yùn)、 組裝等系統(tǒng)資源進(jìn)行功能性Fab分子的裝配和分泌。對(duì)于雙順反子設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)的載體, 位于前面的基因的表達(dá)產(chǎn)量往往比后面的高11, 對(duì)本系統(tǒng)而言, 輕鏈的表達(dá)量超出Fd的量。其原因是多方面的, 第一, 這可能因?yàn)樗拗鲗?duì)下游的mRNA的翻譯失去控制所致, 如能把2個(gè)讀碼框分別置于單獨(dú)的啟動(dòng)子之下, 則二者表達(dá)的平衡性將會(huì)得到改善11。第二, 抗體輕鏈容易在質(zhì)周腔中形成L?L二聚體并在其中積聚, 過高溫度能加劇此進(jìn)程, 并且輕鏈能抵抗宿主酶系統(tǒng)的降解; 因此從宿主的蛋白分泌、 折疊等相關(guān)資源利用的角度來說, 過量的輕鏈不利于Fd的生成12。第三, Fd在質(zhì)周腔中比輕鏈

20、更容易降解, 這是因?yàn)镕d分子由抗體重鏈的VH和CH1組成, 缺少Fc段, 失去了其結(jié)構(gòu)的完整性, 在質(zhì)周腔這個(gè)酶系統(tǒng)較為豐富的環(huán)境中, 可能暴露了許多位點(diǎn), 易受到水解酶的攻擊。特別在較高溫度下, 輕鏈的過表達(dá)和Fd的高降解更加劇了二者在組成上的不平衡性。所以本研究采用在較低的溫度下誘導(dǎo), 雖總體的表達(dá)水平降低, 卻可以使上述趨勢得到緩解, 促進(jìn)Fd和輕鏈產(chǎn)量趨于平衡, 利于Fab的組裝和分泌。    【參考文獻(xiàn)】  1 Seeger C, Mason WS. Hepatitis B virus biologyJ. Mol Biol Rev,

21、 2000, 64(1): 51-68.2 Maeda F, Takekoshi M, Nagatsuka Y, et al. Production and characterization of recombinant human anti?HBs Fab antibodiesJ. J Virol Methods, 2005, 127(2): 141-147.3 Muller R, Gubernatic G, Farle M, et al. Liver transplantation in HBs antigen carriers prevention of hepatitis B viru

22、s (HBV) recurrence by passive immunizationJ. J Hepatol, 1991, 13(1): 90-96.4 Kipriyanov SM, Moldenhauer G, Little M. High level production of soluble single chain antibodies in small?scale Escherichia coli culturesJ. J Immunol Methods, 1997, 200(1-2): 69-77.5 Humphreys DP, Glover DJ. Therapeutic ant

23、ibody production technologies: molecules, applications, expression, and purificationJ. Curr Opin Drug Disc Dev, 2001, 4(2): 172-185.6 Barbas CFIII, Burton DR, Scott JK, et al. Phage display: A laboratory manualM. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000: 212-213.7 Grossman TH, Kawsaki ES, Punreddy SR, et al. Spontaneous cAMP?dependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instabilityJ. G