實驗二乙酰膽堿酯酶抑制法快速測定果蔬中的殘留農藥概要

1、實驗二乙酰膽堿酯酶抑制法快速測定果蔬中的殘留農藥目前有機磷、氨基甲酸酯類農藥是我國大量使用的殺蟲劑，雖然這類農藥與過去使用的有機氯農藥相 比，降解速度較快，但在果蔬中的殘留仍然較為嚴重。由于該類農藥能抑制人體內乙酰膽堿酯酶的生理活 性，神經傳導因此受阻，引起神經麻痹乃至死亡，對人類健康造成極大危害。對于果蔬中的農藥通常采用 氣相色譜等方法進行分析，但分析時間長，操作步驟煩瑣，適用于實驗室分析。長期以來在大部分果蔬市 場中，通常采用乙酰膽堿酯酶抑制法進行快速檢測，即以乙酰膽堿酯酶作為檢測試劑，采用農藥殘留檢測 儀，根據(jù)乙酰膽堿酯酶活性變化的程度來測定果蔬樣品中的殘留農藥。一、 實驗目的1. 了解

2、果蔬中殘留農藥的分析方法；2. 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法；3. 理解農藥殘留性評價的意義。實驗原理有機磷和氨基甲酸酯類農藥能抑制昆蟲中樞和周圍神經系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性，造成神經傳導介質乙酰膽堿的積累，影響正常傳導，使昆蟲中毒致死，酶抑制法就是根據(jù)這一昆蟲毒理學原理，對農藥殘 留進行檢測。以乙酰膽堿為底物，在乙酰膽堿酯酶（ACHE）的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫雙對硝基苯甲酸（DNTB ）產生顯色反應，使反應液呈黃色（于410nm處有最大吸收峰）。根據(jù)酶促反應動力學原理，在沒有有機磷和氨基甲酸酯類農藥存在時，底物在酶的催化作用下發(fā)生水解，反應速率可以用吸光度值隨時間

3、的變化率Ko來表示。當有機磷和氨基甲酸酯類農藥加入到酶的顯色體系中時，農藥抑制了酶的活性，影響顯色體系的反應速度，此時體系吸光度隨時間的變化率為Kt,則有機磷和氨基甲酸酯類農藥對酶的活性的抑制率Y的計算公式如下：Y=L 100%KoKo：空白樣品的吸光度隨時間變化曲 率值Kt：樣品溶液的吸光度隨時間變化曲 率值吸光度AKoKt線的斜線的斜計算。 定一次 點如下t1234567AA1A2A3A4A5A6A7其中Ko和Kt都可通過以下過程進行推導和 在樣品的測量過程，選取每隔等步長時間測 吸光度值，3分鐘內共測定7個數(shù)據(jù)點。設數(shù)據(jù) 表：則線性回歸所得 At曲線的斜率K為：1二.ti Ati 二.A

4、7K =、 -S ti)271(A12A23a 4A45A56A67A7) -了仆27) (AA2A7)(12 2272) <(1 27)23（A7 'AJ 2（A6 A2） IA5A3、- 283lg（ ；）2lg（二） |g（|° ：）I71 01 61 0 I51 0- 281112133lg（） 2lg（） lg（嚴）I 7I 6I 5- 28由此結果可以看出，K值的求取可以不需要使用I0值，即實驗中不需要使用蒸餾水來校正I0值，在光源具有穩(wěn)定性的前提下（通過儀器的硬件電路實現(xiàn)），1。值對測量結果不會有影響，這樣就可以簡化步驟，只用測岀空白樣品和實際樣品溶 液的

5、光強li I7,計算岀K0和Kt，最后得岀抑制率 Y值。采用乙酰膽堿酯酶測定殘留農藥時，當酶完全水解底物乙酰膽堿時，溶液顯黃色，其抑制率為0%，當酶活性被農藥抑制而部分水解乙酰膽堿，測定溶液顯淡黃色，出現(xiàn)相應的抑制率，當酶完全被農藥抑制，測定溶液顯無色，抑制率為100%，這樣就可以建立起農藥殘留量與酶活性抑制率之間的關系。因而可以通過測定抑制率的大小來顯示農藥殘留的毒性程度。樣品的毒性等級分為：安全、低毒和高毒。毒性等級 和抑制率之間的關系如下：表4-4抑制率和毒性等級的關系抑制率Y毒性等級< 20%20% 50%> 50%安全低毒咼毒儀器和試劑.儀器農藥殘留檢測儀1臺天平（0.0

6、1g）1臺組織搗碎機1臺一次性手套1雙金屬鑷子1支試管架1個移液管架1個20mL離心試管3支10mL具塞試管4支5mL吸量管5支1 mL吸量管3支（或移液槍（50-250卩L )1 套)2. 試劑提取液：將兩袋粉劑倒入 500mL瓶內，加入510mL蒸餾水，搖勻溶解后備用。稀釋液：將兩袋粉劑倒入 250mL瓶內，加入100mL蒸餾水，搖勻溶解后備用。酶液：每瓶酶粉加 2.6mL稀釋液，搖勻后置 4C備用，配好的酶液在 4C下可使用7天。底物：每瓶底物粉劑中加入 2.6mL蒸餾水，搖勻后置 4 C備用，配好的底物液在 4 C下可使用3天。 冷凍保存可使用15天。顯色劑：將二袋顯色劑粉劑混合瓶內，

7、加入32mL稀釋液，搖勻溶解置 4C下備用。四、實驗步驟1. 樣品預處理戴上手套將蔬菜樣品剪成約1cm2,用天平準確稱取1g剪碎后的蔬菜樣品放入 20mL離心試管中，；加入5mL提取液浸沒葉片，不斷搖振5min，靜置20min后，取上清液2.5mL置于10mL具塞試管中待用。2. 樣品測定空白樣品的測量：向 1支10mL具塞試管中依次加入 2.5mL提取液，0.1mL酶液，0.1mL顯色齊山混勻后將試管放入 37C水浴中放置15分鐘，15分鐘到達時，馬上加入 0.1mL底物混勻， 約1分鐘后倒入比色皿中放入農藥殘留檢測儀進行空白測定，記錄3分鐘內儀器顯示的光強值11、12、14、15、16、1

8、7，計算K。同時做3份平行樣。(2)待測樣品的測量：向盛有待測樣品提取液的具塞試管中，依次加入0.1mL酶液，0.1mL顯色劑混勻，將試管放入 37C水浴中放置15分鐘，15分鐘到達時，馬上加入 0.1mL底物混勻，約1 分鐘后倒入比色皿中放入農藥殘留檢測儀進行測定，記錄3分鐘內儀器顯示的光強值I1 ' I2'I3' 14' I5' 16' I7'計算Kt。同時做3份平行樣。并且計算樣品的抑制率Y，判斷毒性等級。五、數(shù)據(jù)處理通過下列公式計算蔬菜樣品的抑制率，并判斷毒性等級。I1I 2I33lg( 2lg( 2) lg( 3)I 7I 6I 5Koi- (i=1,2,3)28K 01 ' K 0 2 ' K 03K 03I1'I2'I3'3lg(=) 2lg(說)lg