黑胸散白蟻腸道具內(nèi)切葡聚糖酶活性 - 省略 - 生菌的篩選

1、【收稿日期】2012-05-18【基金項(xiàng)目】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)第八批大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2010227;蚌埠市白蟻防治研究所科研基金(KJ2010001【作者簡介】濮龍軍(1990-,男,本科在讀,Email :pulongjun _cool126com ;龍雁華(1980-,通訊作者,Email :yyq_lyhahaueducn文章編號:1005-376X (201212-1083-05【論著】黑胸散白蟻腸道具內(nèi)切葡聚糖酶活性共生菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化濮龍軍1,王進(jìn)文1,龍雁華1,王眾2,何基伍2,黃中山2(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥230036;2安徽省蚌埠市白蟻防治研究

2、所,安徽蚌埠233000【摘要】目的從黑胸散白蟻腸道內(nèi)篩選獲得具有降解纖維素性能的菌株,并對菌株最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。方法采用篩選性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,通過培養(yǎng)性狀、顯微觀察及16S rDNA 部分片段同源性分析進(jìn)行菌種鑒定,利用正交試驗(yàn)優(yōu)化該菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方以及單因子試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件。結(jié)果通過鑒定,獲得的菌株屬檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp B03,最適產(chǎn)酶的碳氮源為CMC-Na 和蛋白胨。該菌株最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方為CMC-Na 50g /L 、蛋白胨50g /L 、NH 4Cl 06g /L 、KH 2PO 409g /L 、MgSO 409g /L ;最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條

3、件為起始pH 50,溫度35,裝液量20 30mL /150mL 。結(jié)論經(jīng)過優(yōu)化,可將該菌株產(chǎn)生的纖維素酶酶活力從0184U /mL 提高到0311U /mL ,該研究結(jié)果對纖維素酶的工業(yè)開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義?！娟P(guān)鍵詞】黑胸散白蟻;檸檬酸桿菌屬;內(nèi)切葡聚糖酶;酶活力;篩選【中圖分類號】Q939121【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】AScreening ,identification and culture condition optimization of an endoglucanase-produ-cing strain from Reticulitermes chinensis SnyderPU Lon

4、g-jun 1,WANG Jin-wen 1,LONG Yan-hua 1,WANG Zhong 2,HE Ji-wu 2,HUANGZhong-shan 2(1School of Life Sciences ,Anhui Agricultural University ,Hefei 230036,China ;2Institute of Termite Con-trol of Bengbu ,Bengbu 233000,China 【Abstract 】ObjectiveTo obtain strains with cellulose degradation ability from the

5、 digestive tract of Reticulitermeschinensis Snyder and optimize the culture conditions for bacteria enzyme productionMethodsScreening medium was used forisolation of endoglucanase-producing bacteria and the result of strain identification was based on microscopic observation ,cul-ture characteristic

6、s and phylogenetic analysis of 16S rDNA PCRThe optimal medium for endoglucanase production was opti-mized by orthogonal test and optimal conditions were optimized by single factor testResultsStrain B03with activity of en-doglucanase was identified as Citrobacter The optimal carbon source and nitroge

7、n source for enzyme production were CMC-Na and peptoneThe optimal medium for enzyme production was composed of CMC-Na 50g /L ,peptone 40g /L ,NH 4Cl 06g /L ,KH 2PO 405g /L and MgSO 409g /LThe optimal enzyme-producing conditions were initial pH 50,35C and liquid volume 20-30mL per 150mL shake flaskCo

8、nclusionAfter optimization ,the enzyme activity can reach up to0311U /mL from 0184U /mLThe result of this study has certain guiding significance to industrialization of cellulose【Key words 】Reticulitermes chinensis Snyder ;Citrobacter ;Endoglucanase ;Enzyme activity ;Screening纖維素是地球上產(chǎn)量最大的光合產(chǎn)物,而這種可再生

9、的有機(jī)物資源卻一直未能得到充分的利用1,2。如何能將這些富含纖維素的可再生資源高效、便捷的降解轉(zhuǎn)化為乙醇及可利用的糖類,是人們一直在研究探索的課題。纖維素酶是一類降解纖維素成葡萄糖的多組分酶的總稱。根據(jù)酶的性質(zhì)與功能,大體上可將其分為外切葡聚糖酶(EC 32191、內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3214和-葡聚糖苷酶(EC 32121三種3。而纖維素的降解實(shí)際上是這三種組分協(xié)同作用的結(jié)果。白蟻及其共生系統(tǒng)擁有豐富的纖維素酶基因資源,正日益成為人們研究纖維素酶的熱門物種。從解剖學(xué)和社會(huì)組織性角度可以將白蟻分為低等白蟻和高等白蟻。鑒于低等白蟻具有以木質(zhì)材料為食的能力4,5,本研究采用羧甲基纖維素鈉為底物,從

10、低等白蟻腸道中篩選出4株具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的菌株,并對其中一株具有較強(qiáng)活性的菌株(編號為B03通過培養(yǎng)性狀、初步顯微觀察和16S rDNA3801中國微生態(tài)學(xué)雜志2012年12月第24卷第12期DOI:10.13381/ki.cjm.2012.12.003PCR方法初步確定了其分類地位;同時(shí)還對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究,從全新的角度為白蟻防治提供了理論依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方法11材料111樣品黑胸散白蟻,采自合肥市大蜀山,寄主為香樟樹。112培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基6,7。培養(yǎng)基A(LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L;培養(yǎng)基B(LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10g

11、/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L,瓊脂18g/L。培養(yǎng)基C (篩選性培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L,瓊脂18g/L,羧甲基纖維素(低粘度300 800單位5g/L;培養(yǎng)基D:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L,瓊脂18g/L,羧甲基纖維素鈉(低粘度300 800單位5g/L,剛果紅05g/L。種子培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉10g/L。113主要儀器和試劑721型紫外分光光度計(jì)(上海第三儀器廠;HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(上海博訊;ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩箱(上海智城分析儀器公司;5415R高速冷凍離心機(jī)(德

12、國Ep-pendorf。DNS試劑(3,5-二硝基水楊酸;02%剛果紅染液;1mol/L NaCl;羧甲基纖維素鈉。12實(shí)驗(yàn)方法121材料預(yù)處理在無菌操作臺內(nèi)挑選大小均一的成熟工蟻10只,用75%酒精進(jìn)行體表消毒后,小心取出腸道,放置于組織研磨管里進(jìn)行研磨,待用。122菌株初篩將組織研磨液分別稀釋10倍、100倍和1000倍,各取50L均勻涂布在培養(yǎng)基D 上,置于37培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日觀察平板,標(biāo)記出現(xiàn)水解圈的菌株。123菌株復(fù)篩將初篩得到的菌株接種于培養(yǎng)基A中,于37,130r/min培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后,用培養(yǎng)基A調(diào)整各菌懸液的A600值至相同后,取5L 滴在培養(yǎng)基C、D上的對應(yīng)位置,

13、置于37培養(yǎng)箱培養(yǎng)。往培養(yǎng)基C中倒入一定量的02%剛果紅染液,染色30min,再用1mol/L的NaCl清洗2次。在日光燈下觀察水解圈,并拍照。同時(shí)測量培養(yǎng)基D上對應(yīng)菌落水解圈的大小,以挑選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌落進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。124菌株的形態(tài)觀察對培養(yǎng)基C上的菌落進(jìn)行特征描述,并挑取少量菌體置于顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察,拍照記錄。125菌株分子鑒定采用菌落PCR方法擴(kuò)增菌株的16S rDNA部分序列。PCR擴(kuò)增采用引物27f (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-38和1492r(5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-39。反應(yīng)體系為:滅菌去離子水171L,10PCR buf

14、fer(含Mg2+ 25L,dNTPs(2mM30L,27f(10M10L, 1492r(10M10L,rTaq DNA polymerase (2U/L02L,模板02L,總體積25L。反應(yīng)程序?yàn)?94,3min(94,30s50,30s72,4min25cycles72,10min。PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。通過NCBI網(wǎng)站BLAST程序?qū)⑺鶞y序列與GenBank 中核酸序列進(jìn)行比對分析,并基于相關(guān)屬菌株的16S rDNA序列,利用MEGA50軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行種屬鑒定10。126菌株最適產(chǎn)酶碳氮源的篩選11設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組,編號為1 7。實(shí)驗(yàn)組

15、1 4培養(yǎng)基配方分別以葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、淀粉10g/L、CMC-Na 10g/L為碳源,蛋白胨5g/L和NaCl10g/L固定;實(shí)驗(yàn)組5 7培養(yǎng)基配方分別以酵母粉5g/L、硫酸銨5g/L、尿素5g/L為氮源,葡萄糖10g/L和NaCl 10g/L固定;每組重復(fù)3次。每組接種量均為2%, 37,130r/min培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min取上清液,即為粗酶液。采用DNS法測定各組粗酶液的酶活力。以酶活力為指標(biāo)獲得最適產(chǎn)酶碳氮源。127酶活測定12,13本實(shí)驗(yàn)規(guī)定:每分鐘催化產(chǎn)生1mol產(chǎn)物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。單位為IU/mL或U/mL。

16、按公式(1計(jì)算單位體積的酶活力。單位體積酶活力(IU/mL=(m1m26104180tv(1(1式中:m1為酶解液中還原糖的量(mg;m2為酶液中還原糖的量(mg;180為葡萄糖摩爾質(zhì)量(g/mol;t為水解時(shí)間(s;v為粗酶液體積(mL。還原糖的量按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算,公式為y= 0851x0097,r2=0999。酶活測定體系為:先將粗酶液05mL、CMC-Na15mL、緩沖液15mL置于37水浴30min,反應(yīng)結(jié)束加入DNS15mL,沸水浴5min,在540nm處測量紫外吸收值。對照組用失活的粗酶液替代。128菌株最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方的優(yōu)化13 15本實(shí)驗(yàn)采用L16(45正交表,選取C

17、MC-Na、蛋白胨、NH4Cl、KH2PO4、MgSO45個(gè)因素,分別設(shè)計(jì)4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn),通過SPSS170軟件進(jìn)行極差、均值統(tǒng)計(jì)分析,篩選最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方。正交試驗(yàn)方案4801Chinese Journal of Microecology,Dec2012,Vol24No12見表1。每組設(shè)3個(gè)重復(fù),滅菌后按2%接種量接種,并于37、130r /min 培養(yǎng)18h 。培養(yǎng)結(jié)束后,菌懸液于4、5000r /min 離心10min ,獲得粗酶液。酶活測定同127。表1液體培養(yǎng)基L 16(45正交試驗(yàn)因素水平表水平因素(g /L A (CMC-Na B(蛋白胨C (NH 4Cl D (KH 2

18、PO 4E (MgSO 413020060303240301005053504014070746050180909129菌株最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化在128實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。其中,最佳培養(yǎng)溫度試驗(yàn)設(shè)置25、30、35、40和45五個(gè)水平,最佳起始pH 設(shè)置40、50、60、70、80和90六個(gè)水平;最佳裝液量設(shè)置20、30、40、50和60mL 五個(gè)水平。各組培養(yǎng)條件與酶活測定方法同127。2結(jié)果21菌株篩選經(jīng)過初篩和復(fù)篩,共篩選到4株能產(chǎn)生黃色水解圈的菌株,分別編號B01、B02、B03和B04。同時(shí),測量了4個(gè)菌株在培養(yǎng)基D 上的生長情況及水解圈大小的變化情況,見

19、表2。結(jié)果可以看出,B03的平均生長速率以及水解圈直徑都明顯高于其他的3個(gè)菌株。因此,選取B03作為本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究對象。表2菌株在培養(yǎng)基D 上的生長情況(cm 編號1d 2d3d4d5dA B A B A B A B A B 平均生長速率(cm /d B01050060070090100130110145130175026B02030037050065080100095120120150024B03070090100130120155125160140185028B04040050065085090110095125100135020注:A 為菌落直徑,B 為水解圈直徑。22菌株鑒定221

20、形態(tài)特征B03菌株經(jīng)過LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后,肉眼觀察到該菌株的菌落形態(tài)表面光滑,有光澤,低凸,濕潤,不透明,灰白色,邊緣整齊。經(jīng)油鏡觀察(見圖1,菌體為桿狀或棒狀,革蘭染色陰性。222分子鑒定PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果得到長度為1445bp 的16S rDNA 部分序列?；谙嚓P(guān)屬菌株的16S rDNA 序列構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2。如圖所示,菌株B03與GU458277處在同一分支,二者序列相似性為99%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征,初步判定分離菌株為Citrobacter 屬細(xì)菌,命名為Citrobacter spB03 。圖1顯微鏡下觀察的菌體形態(tài)(100倍 圖2基于相關(guān)屬菌株的16S rDNA 序列構(gòu)

21、件系統(tǒng)發(fā)育樹5801中國微生態(tài)學(xué)雜志2012年12月第24卷第12期23最適產(chǎn)酶條件的研究231最適產(chǎn)酶碳氮源的篩選篩選結(jié)果如圖3、圖4所示,該菌株最適產(chǎn)酶的碳氮源分別為CMC-Na 和蛋白胨。232最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方的正交優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。極差(R分析表明,5個(gè)因素中MgSO4對酶活力影響最為顯著,各因素對產(chǎn)酶影響的主次順序?yàn)镋ADBC。從均值I 理論分析來看,因素1在水平3、因素2在水平4、因素3在水平1、因素4在水平4、因素5在水平4的時(shí)候酶活力最高。因此,培養(yǎng)基優(yōu)化的配方組合為A3B4C1D4E4,即CMC-Na50g/L、蛋白胨50g/L、NH4Cl06g/L、KH2PO409

22、g/L、MgSO409g/L。24最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化241起始pH對產(chǎn)酶的影響圖5表明,培養(yǎng)基起始pH為50時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng);低于或高于50時(shí),產(chǎn)酶能力明顯下降。242溫度對產(chǎn)酶的影響由圖6可以看出,在35時(shí)酶活力最強(qiáng),溫度高于或低于35其產(chǎn)酶能力顯著下降。243裝液量對產(chǎn)酶的影響由圖7可以看出培養(yǎng)基裝液量對產(chǎn)酶的影響十分明顯,較適宜的裝液量為20 30mL,最適裝液量為30mL。這說明該菌株產(chǎn)酶對溶氧有較高要求。當(dāng)裝液量高于30mL時(shí),由于溶氧量不足,產(chǎn)酶能力顯著下降 。圖3 不同碳源對酶活力的影響圖4不同氮源對酶活力的影響表3培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)組因素A因素B因素C因素D因素E

23、酶活力(U/mL 11111101750007 21222202150008 31333302140015 41444402570001 52123402450028 *2460025 *2010007 82432102110012 93134202360013 103243102170014 113312402730027 *2410018 134142302360004 144231402550012 154324102200008 164413202430013均值0215003302230032023400420218003702060021均值02260023023300200230

24、00150234002802240019均值0242002302270032022900210230001702340014均值0239001502380019022800240240001602580012極差R002700150006002200526801Chinese Journal of Microecology,Dec2012,Vol24No12 圖5培養(yǎng)基起始pH 對酶活力的影響圖6 溫度對酶活力的影響圖7裝液量對酶活力的影響25優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶能力與優(yōu)化前的比較在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,配制最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基,以2%接種量進(jìn)行接種后分別按優(yōu)化的培養(yǎng)條件(起始pH 50,35

25、,裝液量30mL 和優(yōu)化前培養(yǎng)條件(起始pH 自然,37,裝液量20mL 進(jìn)行培養(yǎng),轉(zhuǎn)速130r /min ,培養(yǎng)18h 。結(jié)束后測定粗酶液酶活,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出,經(jīng)過優(yōu)化后該菌株的產(chǎn)酶能力得到很大的提高,相比優(yōu)化前提高690%。3討論本試驗(yàn)經(jīng)過菌種的初篩和復(fù)篩,在有氧條件下篩選出一株對纖維素具有一定降解能力的菌株B03,而該菌是生存在白蟻高度厭氧的腸道環(huán)境中的,說明該菌株為兼性厭氧菌,且在有氧和厭氧環(huán)境下都可以分泌纖維素酶。經(jīng)過培養(yǎng)性狀、顯微觀察及16S rDNA PCR 方法初步鑒定該菌株屬于檸檬酸桿菌屬,但由于未對該菌的生理生化進(jìn)行過多的研究,該菌株屬于檸檬酸桿菌屬中的

26、哪一個(gè)物種還有待進(jìn)一步研究 。圖8菌株產(chǎn)酶能力優(yōu)化前后的比較白蟻腸道菌一般為厭氧菌,并且絕大多數(shù)厭氧菌都是較難培養(yǎng)的或至今未能人工培養(yǎng)的。本試驗(yàn)成功從白蟻腸道中篩選到一株兼性厭氧菌,且其產(chǎn)酶能力對氧濃度的要求還比較高。從而打破了從白蟻腸道發(fā)掘產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌非常有限的傳統(tǒng)觀念,為進(jìn)一步大量篩選具有木質(zhì)纖維素降解能力的菌株提供了一定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?避免了厭氧操作的限制。本實(shí)驗(yàn)僅針對最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件做了初步研究,離實(shí)際應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離,還需要進(jìn)一步展開實(shí)驗(yàn)。如要獲得最大量的菌體,則還要研究該菌的最適生長條件,可以對菌種生長的碳氮源以及其他的培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,研究降解機(jī)制

27、,利用基因工程方法構(gòu)建、誘變產(chǎn)生更高效的降解菌株等?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1LEWIS S M ,MONTGOMERY L ,GARLEB K A ,et alEffects of alka-line hydrogen peroxide treatment on in vitro degradation of cellulosic substrates by mixed ruminal microorganisms and Bacteroides succino-genes S85J Appl Environ Microbiol ,1988,54(5:1163-11692PETRE M ,ZARNEA

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35、ubstitutions in Penicill inand 2B J Chin J Pediat， 2010 ， 48 （ 1 ） ： 6064 （ in Chinese） 1A、 2X 徐敏， 張建華， 丁云芳， 等 肺炎鏈球菌青霉素結(jié)合蛋白 2B、 中華 氨基酸置換對 內(nèi)酰胺類抗生素最小抑菌濃度的影響J 2010 ， 48 （ 1 ） ： 6064 兒科雜志， 結(jié)構(gòu)徹底改變通道入口的特性， 影響 PBP1A 對帶負(fù) 電荷的 內(nèi)酰胺類抗生素的初步識別， 并且 Thr 支鏈 作為疏水核心的一部分可以穩(wěn)定 螺旋結(jié)構(gòu)。 Thr 螺旋結(jié)構(gòu)失 Ala 的置換可以導(dǎo)致疏水核心以及 使 PBP1A 的活

36、性改變。 不是所有 內(nèi)酰 去穩(wěn)定性， 胺類抗生素耐藥菌株均有 PBP1A 區(qū)域 SSN ASN， PBP2B 區(qū)域 SSN 保守序列附近 T A （ 蘇氨酸 丙氨 酸） ， 提示 PBP1A 可能在 PBP2B 變異的基礎(chǔ)上， 共同 增加 S pneumoniae 對 內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。 8 這與以往的報(bào)道相一致 。 本研究顯示臺州地區(qū) S pneumoniae 對 內(nèi)酰胺 PBP2B ， PBP2X 變 類抗生素耐藥機(jī)制主要與 PBP1A， PBP1A 和 PBP2X 可能是在 PBP2B 變異的基 異有關(guān)， 礎(chǔ)上進(jìn)一步增加 S pneumoniae 對 內(nèi)酰胺類抗生素 而本地區(qū)耐藥菌

37、株的 PBPs 氨基酸置換與 的耐藥性， 內(nèi)酰胺類抗生素 MIC 值的關(guān)系， 還有待于進(jìn)一步 研究。在當(dāng)前 內(nèi)酰胺類抗生素廣泛使用的情況 有必要繼續(xù)監(jiān)測 S pneumoniae 在抗生素選擇性 下， 壓力下產(chǎn)生與耐藥有關(guān)的遺傳改變 。 【參考文獻(xiàn)】 1 POLAND G A The burden of pneumococcal disease： the role of conju1999 ， 17 （ 1314 ） ： 16741679 gate vaccinesJ Vaccine， 2 NICHOL K A， ZHANEL G G， HOBAN D J PenicillinBinding

38、protein 2B， and 2X alterations in Canadian isolates of penicillinresistant 1A， 櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆 （ 上接第 1087 頁） 相輝， 周志華 白蟻及共生微生物木質(zhì)纖維素水解酶的種類J 2009 ， 46 （ 1 ） ： 3240 昆蟲知識， 6 SHEN Ping， FAN Xiurong， LI Guangwu Microbiology testM Beijing： Higher Education Press， 2002 ： 9295

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40、2 （ 1 ） ： 3335 8EDWARDS U， ROGALL T， BLCKER H， et al Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNAJ Nucleic Acids Res， 1989 ， 17 （ 19 ） ： 78437853 9 WEISBURG W G， BARNS S M， PELLETIER D A， et al 16S ribosomal DNA amplifi