dd斑馬魚作為慢性酒精性肝病動(dòng)物模型的研究_圖文

1、斑馬魚作為慢性酒精性肝病動(dòng)物模型的研究昆明第一中學(xué) 陳紫楠摘要:近年來我國由酒精所致肝損害的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì) , 酒精性肝病 (Alcoholic liver disease ,ALD在人群中已屬多發(fā)病和常見病。目前已建立了小鼠、大 鼠等酒精性肝病動(dòng)物模型,均為灌胃成模,未見自然飲酒成模,與人自然飲酒成酒 精性肝病差異較大,基于此,選用世代周期短、形體小、胚胎發(fā)育快、操作簡便以 及具有和人類相似的基因結(jié)構(gòu)的斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)材料, 在 1.5%(V/V%的乙醇溶液中 飼養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在飼養(yǎng)四十天后,血清和肝臟中的 ALT (谷草轉(zhuǎn)氨酶 、 AST (谷 丙轉(zhuǎn)氨酶和 MDA (丙二醛均高于不含酒

2、精飼養(yǎng)的對(duì)照組。肝臟病理切片顯示:乙醇溶液飼養(yǎng)四十天后,對(duì)照組斑馬魚肝細(xì)胞排列均勻,細(xì)胞質(zhì)、核結(jié)構(gòu)清晰,無 明顯病變,而酒精喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚肝組織結(jié)構(gòu)被破壞,肝細(xì)胞廣泛脂肪變性,出 現(xiàn)空泡樣變性和氣球樣變性,細(xì)胞體積增大,可見炎癥細(xì)胞浸潤,部分細(xì)胞壞死, 淤血。 上述生化特征和病理特征說明我們已成功構(gòu)建成酒精性肝病斑馬魚動(dòng)物模型, 為進(jìn)一步研究酒精性肝病的致病機(jī)理提供了新的動(dòng)物模型,并進(jìn)一步拓廣了斑馬魚 的應(yīng)用范圍。用斑馬魚自然飲酒方法建立斑馬魚酒精性肝病動(dòng)物模型,經(jīng)查新未見 報(bào)道。關(guān)鍵詞 :斑馬魚 酒精性肝病 動(dòng)物模型小時(shí)候,爸爸媽媽給我從花鳥市場買來了一種可愛的小魚,它們身上有像斑馬 一樣

3、的條紋,叫斑馬魚。我一見就喜歡上了它們,從此就和這種美麗的小精靈結(jié)下 了不解之緣。由于自己養(yǎng)斑馬魚,所以平時(shí)就對(duì)一些關(guān)于斑馬魚的小知識(shí)比較關(guān)注, 日子長了,對(duì)這種小魚的的了解就更多了一些,知道這種小魚不僅可供觀賞,還可 以做科學(xué)研究呢。爸爸平時(shí)比較愛喝酒,有時(shí)有好朋友來興致一高,難免會(huì)多喝, 媽媽由于擔(dān)心爸爸的身體,經(jīng)常會(huì)嘮叨幾句,說飲酒會(huì)造成酒精性肝損傷,可往往 收效甚微。一個(gè)偶然的機(jī)會(huì),我看到一篇關(guān)于斑馬魚作為腫瘤動(dòng)物模型研究的報(bào)道, 忽然想, 那我能不能用這些小魚做一個(gè)關(guān)于酒精損害肝臟的動(dòng)物模型來教育爸爸呢。 碰巧有一個(gè)機(jī)會(huì),學(xué)校組織我們?nèi)ブ袊t(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所參觀,我趁機(jī) 請(qǐng)教

4、了那里的專家,把我的這個(gè)想法告訴了他們,老師們認(rèn)為我這個(gè)想法即有創(chuàng)新性也很有意義,操作起來也比較可行。因此我就在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究 所進(jìn)行了該項(xiàng)研究。通過查閱文獻(xiàn),我了解到酒精性肝病 (ALD是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾 病。 ALD 包括輕癥酒精性肝病 (MAI、酒精性脂肪肝 (AFL、酒精性肝炎 (AH、酒精 性肝纖維化 (AHF和酒精性肝硬化 (AC(王輝等, 1998 。酒精濫用和依賴已成為當(dāng) 今世界日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。對(duì)我國 4大地區(qū)飲酒情況的流行病學(xué)調(diào)查表明 , 一 般人群的飲酒率為 59.5%,其中男性占 84.6%,女性占 29.4%,人均年飲酒量折合 3.6L

5、純酒精 (100% 。 酒精對(duì)肝臟有明顯的毒性作用 , 重度飲酒者中 90%100%有一定程 度的脂肪肝 ,10%35%可發(fā)展成酒精性肝炎 , 8%20%將發(fā)展為肝硬化 (厲有名等, 2003 。 美國酒精性肝病死亡居第 10位 , 每年約 15002000人死于酒精性肝病。 我國 酒精性肝病在所有肝病中的比例有逐年增加趨勢(shì) , ALD是西方國家導(dǎo)致肝硬化的最 主要病因 , 也是十大常見死因之一。近年來我國由酒精所致肝損害的發(fā)病率亦呈逐年 上升趨勢(shì) , 酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因 , 在人群中已屬多發(fā) 病和常見病(孫艷等, 2006 。斑馬魚(Denio rerio一種熱帶

6、硬骨魚,是研究脊椎動(dòng)物器官發(fā)育和人類疾 病的重要遺傳學(xué)模型之一。其顯著優(yōu)勢(shì)在于:體積小(34cm ,可在較小的空間大 量繁殖;產(chǎn)卵量高(每周產(chǎn)卵可達(dá) 200多個(gè) ,發(fā)育快,許多組織在受精后 24小時(shí) 開始形成;成熟周期短(34個(gè)月 ;體外受精且胚胎透明,發(fā)育過程可在體視解剖 鏡下觀察。斑馬魚的這些特點(diǎn)使它適宜作大規(guī)模的突變篩選,是研究基因功能和脊 椎動(dòng)物發(fā)育機(jī)制的重要手段(程烽等, 2004 。斑馬魚與人類基因在引起相關(guān)疾病時(shí) 的表型極為相似 , 由此可將斑馬魚作為研究人類疾病的重要模式生物體(江曉曦等, 2004 。目前對(duì) ALD 發(fā)病機(jī)制的了解在很大程度上取決于動(dòng)物模型的可靠性和可重 復(fù)性

7、,以及模型與人類 ALD 的相似性,為了深入研究本病的發(fā)病機(jī)制,篩選防止酒 精性肝病的有效藥物,改進(jìn)并完善 ALD 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是十分必要的(孫艷等, 2006 。酒精性肝病的動(dòng)物模型主要為大鼠、小鼠等,均為灌胃成模,未見自然飲酒 成模,與人自然飲酒成酒精性肝病差異較大(徐立等, 2006 ,現(xiàn)有資料表明斑馬魚 可作為人類發(fā)育與疾病等研究的模式動(dòng)物(耿波等, 2006 ,文獻(xiàn)檢索未見有用斑馬 魚作酒精性肝病動(dòng)物模型的報(bào)道,因此,我采用喂養(yǎng)酒精斑馬魚的方式模擬人類酗 酒,從生化和組織病理等方面對(duì)其作為慢性酒精性肝病特征進(jìn)行研究,最終建立了酒精性肝病斑馬魚動(dòng)物模型。1. 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材

8、料1.1.1 主要試劑總膽固醇(TC 、三酰甘油(TG 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST 、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT 測 定試劑盒, 均由中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn); 總蛋白 (TP 、 白蛋白 (ALB 測定試劑盒,均由上海長征-康仁醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn);考馬斯亮蘭、丙二醛 (MDA 、 超氧化物岐化酶 (SOD 測定試劑盒, 均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。 乙醇、二甲苯、石蠟、丙酮等為常規(guī)試劑。玻因 (Bouin 氏固定液按以下配方配制:苦味酸飽和水溶液 (0.9%1.2% 75ml , 甲醛 25ml,冰醋酸 5ml(用前加入 。1.1.2 主要儀器Lisa 300全自動(dòng)生化分析儀,分光光度計(jì),電

9、動(dòng)玻璃勻漿器,鑷子,手術(shù)剪,載 波片,蓋薄片,自動(dòng)切片機(jī),展片器,倒置顯微鏡,干燥箱,加熱棒,加氧泵。 1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚, 500只,購自昆明景星街花鳥市場。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 酒精飼養(yǎng)濃度的選擇及分組為篩選最佳的酒精飼養(yǎng)濃度, 我們將斑馬魚隨機(jī)取 60只用于酒精飼養(yǎng)濃度的選 擇:設(shè)定四個(gè)乙醇濃度條件組:1%、 1.5%、 2%、 2.5%進(jìn)行了小量飼養(yǎng)預(yù)實(shí)驗(yàn),每組 15只。取 400只隨機(jī)分為 2組,一組為正常對(duì)照組,另一組為實(shí)驗(yàn)組,每組 200只。 1.2.2 處理方法實(shí)驗(yàn)組用 2升 1.5%的酒精喂養(yǎng),用加熱泵保持水溫約 26,隔天換水,連續(xù) 40天;正常對(duì)照組在相同條

10、件下用 2升水喂養(yǎng),每組給餌料 2克 /天。1.2.3 標(biāo)本采集各組斑馬魚末次換水后,自眼球采血,采集的血每 66只合并為一組,實(shí)驗(yàn)組及 對(duì)照組各 3組, 置于 37溫箱 30min 后, 4過夜分離血清。 采血后即刻處死, 稱重,每組取肝, 其中 60只斑馬魚肝臟加生理鹽水制成 10%肝勻漿, 剩余肝臟放入玻因氏 固定液中固定。1.2.4 生化測定方法采集的血清及肝臟組織,送昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測。用全自 動(dòng)生化分析儀檢測 ALT 、 AST 、 TC 和 TG 等; MDA 、 SOD 采用比色法,按照試劑 盒說明進(jìn)行。1.2.5 肝組織病理檢測玻因固定液固定的肝臟依次用 8

11、0%酒精、 95%酒精、純酒精、丙酮、二甲苯、 石蠟處理脫水后,將已脫水的肝臟取出,用 5658的熱石蠟進(jìn)行包埋,包埋后制 成蠟塊,在切片機(jī)上切成厚度 67 m 的切片后,蘇木精 -伊紅染色(HE 染色 ,顯 微鏡觀察肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和病理改變。 (姜元慶, 20021.2.6 肝指數(shù)計(jì)算公式 肝指數(shù) =肝臟重量 /體重。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用 +s表示,兩組之間的比較用 T 檢驗(yàn)。 (孫振球,20062 結(jié)果2.1 酒精飼養(yǎng)濃度的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 2%和 2.5%濃度組,飼養(yǎng) 7天后有大量斑馬魚死亡,而 1%和 1.5%濃 度組未見死亡,因此我們最后確定使用 1.5%乙醇濃度作為最終飼

12、養(yǎng)濃度。表 1 酒精濃度對(duì)斑馬魚的影響組別 動(dòng)物數(shù)量 斑馬魚存活狀態(tài)(7天1%酒精組 15條 存活 15條1.5%酒精組 15條 存活 15條2%酒精組 15條 死亡 13條2.5%酒精組 15條 死亡 15條2.2外部形態(tài)特征飼養(yǎng) 40天時(shí),酒精飼養(yǎng)的斑馬魚游泳狀態(tài)出現(xiàn)游速緩慢,進(jìn)食量減少,有的出 現(xiàn)身體微微側(cè)偏,正常對(duì)照組游動(dòng)速度較快,較活潑,進(jìn)食量正常。因此我們選擇 酒精飼養(yǎng) 40天進(jìn)行生化和病理特征研究。 酒精飼養(yǎng)組外觀與正常對(duì)照的斑馬魚對(duì)比,體重?zé)o顯著差異,腹部略微發(fā)白(圖 1 。解剖后對(duì)比肝臟,兩組肝臟均呈紅色(圖 2 。 圖 1 飼養(yǎng) 40天后的斑馬魚(箭頭所示A. 正常對(duì)照;

13、B. 酒精飼養(yǎng) 圖 2 飼養(yǎng) 40天后的斑馬魚肝臟(箭頭所示A. 正常對(duì)照; B. 酒精飼養(yǎng)2.3 肝指數(shù)酒精飼養(yǎng) 40天后肝指數(shù)大于正常對(duì)照組, 說明酒精飼養(yǎng)對(duì)斑馬魚肝臟造成一定 的損傷 (表 2 。表 2 酒精對(duì)斑馬魚肝損傷肝指數(shù)的影響組別 動(dòng)物數(shù) 體重 (g 肝臟重量 (g 肝指數(shù) (g/g 正常對(duì)照組 20 0.354±0.062 0.0068±0.0007 0.0192±0.005 酒精飼養(yǎng)組 21 0.348±0.047 0.0073±0.0009 0.021±0.0062.4 MDA和 SOD 變化特征結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組斑

14、馬魚的血清和肝組織勻漿中 MDA 的水平顯著高于對(duì)照組,并且實(shí)驗(yàn)組斑馬魚的血清和肝組織勻漿中 SOD 的水平顯著低于對(duì)照組 (表 3 。說明飲酒后引起自由基的過量產(chǎn)生,造成損傷。表 3 酒精對(duì)斑馬魚血清及組織中 MDA 和 SOD 的影響(+s, mmol/ml, n=3MDA SOD 組別血清 肝組織勻漿 血清 肝組織勻漿正常對(duì)照組 7. 83±3.42 7.71±2.27 186±43.71 3.63±1.22實(shí)驗(yàn)組 13.25±4.85 21.63±5.72 153±19.31 2.47±0.832.5 血清

15、 ALT 、 AST 、 TC 、 TG 的變化特征飲酒后斑馬魚肝功能 ALT 和 AST 水平顯著高于正常對(duì)照組, TG 水平顯著高于對(duì)照組, TC 水平低于對(duì)照組 (表 4 。說明飲酒后酒精對(duì)肝臟造成損傷。表 4 酒精飼養(yǎng)對(duì)斑馬魚血清生化學(xué)的影響(+s , n=3組別 ALT(U/L AST(U/L TC(mmol/LTG(mmol/L正常對(duì)照組 52.3±2.85 162.6±31.7 2.52±0.85 1.26±0.61酒精飼養(yǎng)組 64.2±8.76* 241.5±35.5* 2.49±0.73 2.31±

16、;0.77*注:與正常組比較, *P<0.052.6 病理檢測結(jié)果顯微鏡下觀察,正常對(duì)照組斑馬魚肝細(xì)胞排列均勻,細(xì)胞質(zhì)、核結(jié)構(gòu)清晰,無明顯病變(圖 3A 。而酒精飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚肝組織結(jié)構(gòu)被破壞,肝細(xì)胞廣泛脂肪變性,出現(xiàn)空泡樣變性和氣球樣變性,細(xì)胞體積增大,可見炎癥細(xì)胞浸潤,部分細(xì)胞壞死,淤血(圖 3B-G 。AB C D EF G 圖 3 酒精飼養(yǎng)后斑馬魚肝臟病理特征變化A 正常對(duì)照組斑馬魚肝細(xì)胞切片 (×400B 肝臟淤血,肝細(xì)胞腫大(×200 C 肝細(xì)胞脂肪變性,肝細(xì)胞空泡樣變性(×200 D 肝 細(xì)胞腫脹,氣球樣空泡樣變性(×200 E 肝

17、細(xì)胞壞死,肝細(xì)胞空泡腫脹(×200 F 肝細(xì)胞氣球樣變性,淤血(×200 G 肝細(xì)胞壞死,肝細(xì)胞腫大,炎癥細(xì)胞浸潤(×2003 討論本實(shí)驗(yàn)通過用 1.5%酒精飼養(yǎng)斑馬魚,從模擬人類酒精性肝病發(fā)生的角度,對(duì)慢 性酒精性肝病的動(dòng)物模型進(jìn)行了探索性研究。結(jié)果顯示, 1.5%飼養(yǎng)酒精可以使斑馬 魚的血清 ALT 、 AST 、 MDA 明顯增高。肝組織病理結(jié)果顯示,正常對(duì)照組肝細(xì)胞排 列整齊,細(xì)胞質(zhì)清晰,肝細(xì)胞無明顯病變;實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞則出現(xiàn)廣泛性的空泡樣變 性,表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大,胞漿疏松、淺染,乃至清亮、透明,部分肝細(xì)胞呈典型 的氣球樣變性。以上結(jié)果說明,我們成功用斑馬

18、魚建立了慢性酒精肝的動(dòng)物模型。 ALD 的臨床分型及其病理診斷標(biāo)準(zhǔn)分為 (1輕型 ALD:肝內(nèi)可見 ALD 的幾種基本病變 , 但程度較輕; (2酒精性脂肪肝 :肝小葉內(nèi) >30%肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變 , 依脂肪變范圍分輕、 中和重度; (3酒精性肝炎 :肝細(xì)胞呈氣球樣變和透明性變 , 細(xì)胞漿內(nèi)可見酒精性透明小 體; (4酒精性肝硬化 :早期結(jié)節(jié)甚為細(xì)小 , 晚期再生結(jié)節(jié)增大 , 界限清楚 , 繞以致密纖維 組織 (丁曄等, 2006 。從病理結(jié)果分析,我們所建立的斑馬魚酒精肝模型屬于酒精性 肝炎。與常見的酒精性肝病動(dòng)物模型(黃哲等, 1998相比較,我們建立斑馬魚慢性 酒精肝動(dòng)物模型的特點(diǎn)

19、是:(1實(shí)驗(yàn)中給動(dòng)物飼喂酒精的過程在一定程度上模擬了 人喝酒的狀態(tài),而其它常用的動(dòng)物模型中常使用灌胃等強(qiáng)迫性手段; (2建模的周 期較其它動(dòng)物模型短, 只需要 40天, 而其它動(dòng)物模型則多需要較長的時(shí)間才能顯效; (3建模成功的動(dòng)物相關(guān)生化檢測指標(biāo)變化及病理特征明顯,易于評(píng)價(jià); (4斑馬 魚的基因與人類相似且相對(duì)簡單,易于操作,便于在分子水平研究疾病發(fā)生發(fā)展的 機(jī)理。斑馬魚作為模型生物已廣泛應(yīng)用人類重大疾病模型的建立,具有發(fā)育周期短、 基因結(jié)構(gòu)清楚的特點(diǎn),適合于研究疾病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)理,我們的進(jìn)一步研究設(shè)想 是:(1研究酒精肝發(fā)生過程中基因的相互作用; (2引起其它并發(fā)癥的基因特征 及其相互作

20、用。4 心得體會(huì)在項(xiàng)目開始,我覺得科學(xué)研究是深不可測的,是離我很遙遠(yuǎn)的事情。但是,好 奇心促使我不斷地查找資料,詢問專家,如同學(xué)校老師所說,發(fā)現(xiàn)科學(xué)研究都是從 問題的提出開始。通過實(shí)驗(yàn)我發(fā)現(xiàn)科學(xué)研究是很辛苦的,它需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度、科學(xué)的方法。在研究過程中,我也遇到了挫折。但是為了獲得研究結(jié)果,我犧牲了很多 的休息時(shí)間,提高了學(xué)習(xí)的效率,懂得了很多課本上沒有提及的專業(yè)知識(shí),掌握了 科學(xué)研究的方法以及創(chuàng)新的思維。在這個(gè)項(xiàng)目的完成過程中,我學(xué)會(huì)了如何利用相關(guān)的文獻(xiàn)檢索工具檢索和查閱 文獻(xiàn)。懂得了如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),比如:實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)立合理的對(duì)照,否則實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)就 沒有說服力,也不科學(xué)。還認(rèn)識(shí)到科學(xué)實(shí)驗(yàn)不僅僅是

21、滿足個(gè)人的好奇心,還需要有 扎實(shí)的知識(shí)功底、過硬的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),再加上充分的準(zhǔn)備和縝密的 科學(xué)思維才能設(shè)計(jì)出科學(xué)、合理的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理也是個(gè)非常嚴(yán)密的過程, 需要認(rèn)真對(duì)比、分析才能得出可靠的結(jié)論。經(jīng)過這次親身體驗(yàn),我深刻感受到科學(xué) 探索是個(gè)非常艱辛的過程,必須付出艱苦的努力才能獲得一點(diǎn)點(diǎn)成就,也不是人們 所看到的鮮花和榮譽(yù)常伴左右,更多的時(shí)候需要信念的支撐和默默地堅(jiān)持。另外, 要想在科學(xué)上有新的突破和新的發(fā)現(xiàn),除了扎實(shí)的功底和艱苦的努力之外,還要有 一顆好奇的心,好奇心是科學(xué)研究的原動(dòng)力,它是一種力量,驅(qū)使著你去撥開荊棘 看個(gè)究竟,推動(dòng)你去不斷開拓創(chuàng)新。這次研究,大大提高了我對(duì)科學(xué)的濃厚興趣, 樹立了我們克服困難的決心,我還會(huì)在科學(xué)的道路上繼續(xù)前進(jìn)。致謝 : 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物