調(diào)肝方藥對(duì)束縛應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的調(diào)節(jié)作用

1、    調(diào)肝方藥對(duì)束縛應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的調(diào)節(jié)作用        摘要目的：探討調(diào)肝方藥對(duì)束縛應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的調(diào)查作用。方法：以束縛制動(dòng)作為應(yīng)激原復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)大鼠模型，采用放射免疫法檢測(cè)模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，同時(shí)檢測(cè)模型大鼠有關(guān)免疫功能的變化，并觀察調(diào)肝方藥的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：束縛應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)興奮亢進(jìn)(P0.01或P0.05)；脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)降低(P0.01)，腹腔巨噬細(xì)胞(M)釋放HO功能下降(P0.01)。

2、而調(diào)肝方藥能抑制HPAA的興奮性，提高大鼠的免疫機(jī)能。結(jié)論：調(diào)肝方藥對(duì)束縛應(yīng)激所引起的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的紊亂具有一定的調(diào)節(jié)作用。主題詞應(yīng)激；下丘腦-垂體系統(tǒng)；免疫，細(xì)胞；巨噬細(xì)胞中分類(lèi)號(hào)R392.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)06-0560-03 Regulation of Tiao Gan Fang Yao on neuroendocrine-immuno-function of bandage-stressed ratsYAN Can, DENG Zhong-yan, WANG Jian(Department of Basic Sciences, Basic Med

3、icine College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Drugs, Guangzhou 510405, China)CHEN Xiao-yin(Department of Traditional Chinese Medical, Jinan University, Guangzhou 510632)Abstract AIM: To investigate the regulation of Tiao Gan Fang Yao(TGFY) on neuroendocrine-immuno-functio

4、n of bandage-stressed rat . METHODS:The stressed rat model was made by bandage. RIA was adopted to measure the function of hypothalamus-pitutary-adrenal gland axis (HPAA) of stressed rat. Meanwhile, the immunity of stressed rat and the regulation of TGFY were observed.RESULTS:Bandage stress increase

5、d the contents of serum corticosterone(CORT), and ACTH, and hypothalamus corticotropin releasing hormone (P0.01 or 0.05), which suggested that the excitability of HPAA was enhanced. In addition, bandage stress reduced spleen lymphocyte proliferation (P0.01) and decreased HO releasing from the macrop

6、hages significantly (P0.01). While TGFY could decrease HPAA excitability of bandage-stressed rat and strengthen its immunity.CONCLUSION:TGFY could regulate disorder of neuroendocrine-immuno-function of bandage-stressed rat.MeSHStress; Hypothalamo-hypophyseal system; Immunity, cellular; Macrophages七情

7、致病理論是中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)中的一個(gè)重要內(nèi)容，但有關(guān)中醫(yī)七情致病機(jī)制的研究開(kāi)展的較少，這可能與很難復(fù)制出符合中醫(yī)七情致病特點(diǎn)的動(dòng)物模型有關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)激學(xué)說(shuō)與中醫(yī)七情理論在認(rèn)識(shí)上存在著許多共同點(diǎn)，我們從應(yīng)激角度出發(fā)，結(jié)合中醫(yī)“怒傷肝”的理論，以束縛制動(dòng)作為應(yīng)激原，復(fù)制激怒應(yīng)激反應(yīng)大鼠模型，并探討調(diào)肝方藥(Tiao Gan Fang Yao, TGFY)對(duì)應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的影響。材料和方法一、主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640(Gibco產(chǎn)品)，刀豆素A(ConA, Sigma產(chǎn)品)，3H-TdR(中國(guó)科學(xué)院原子能研究所產(chǎn)品)。莨菪葶(scopletin, 9.61 g, Sigma

8、產(chǎn)品)，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP, 10 g, Sigma產(chǎn)品)，十四酰佛波乙酸酯(phorbol myristate acetate, PMA, 100 ng, Sigma產(chǎn)品)。125I-CRH、125I-ACTH、125I-CORT放免檢測(cè)藥盒(美國(guó)DPC產(chǎn)品)。二、動(dòng)物模型復(fù)制及分組處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇雄性Wistar遠(yuǎn)交系大鼠，體重250300 g，分為3組：正常對(duì)照組10只(大鼠正常飲食，不給任何刺激)；束縛應(yīng)激組10只(給予束縛刺激，正常飲食，不給中藥治療)；束縛應(yīng)激+調(diào)肝方藥組10只(給予束縛刺激的同時(shí)灌胃調(diào)肝方藥治療)。束縛應(yīng)激反應(yīng)大

9、鼠模型的復(fù)制：取雄性Wistar遠(yuǎn)交系大鼠20只，體重250300 g，每2只1籠，每日給予黑暗和光照各12 h,2022，同時(shí)給予每日1次成對(duì)雙后肢的立式束縛，以引起明顯的激怒應(yīng)激反應(yīng)(粗叫、站立對(duì)峙、扭打嘶咬)，首次30 min，以后隔日增加10 min，共2周。普通飼料，自由飲水。于實(shí)驗(yàn)第13 d和第14 d在動(dòng)物清醒、安靜狀態(tài)下斷頭處死取材。三、藥物組成劑量及給藥方法所用中藥均由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材。調(diào)肝方藥組成及劑量：柴胡15 g，白芍15 g,香附10 g，山萸肉15 g，郁金10 g，枳殼10 g。將上述藥物制成100%水煎劑，每毫升含生藥1 g，給

10、予大鼠1 mL/100 g體重灌胃，每日2次，共2周。對(duì)照組及各應(yīng)激組灌服等量生理鹽水。四、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus-pitutary-adrenal gland axis, HPAA)功能測(cè)定采大鼠血清測(cè)皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT),以EDTA抗凝血測(cè)促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)，具體方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)放免檢測(cè)：按文獻(xiàn)1、2取大鼠下丘腦，并移至備有0.1 mol/L鹽酸

11、2 mol/L醋酸=11的1 mL溶液的試管中。采用組織勻漿器4000 G勻漿20 s，煮沸加熱3 min,2 000×g離心20 min，取上清液保存于-20待測(cè)3，具體檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。五、脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)試驗(yàn)無(wú)菌取脾，F(xiàn)icoll分離脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107mL，每孔0.1 mL,每鼠3個(gè)復(fù)孔。每實(shí)驗(yàn)孔加ConA 5g，對(duì)照孔加等體積完全培養(yǎng)液(RPMI-1640)。每孔總反應(yīng)容積為0.2 mL。飽和濕度，5%CO，37培養(yǎng)40 h，于終止培養(yǎng)前16 h每孔加3.7×104 BqH-TdR。多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞，測(cè)每分鐘計(jì)數(shù)值(co

12、unts.min-1)2。刺激指數(shù)(stimulating index, SI)=實(shí)驗(yàn)孔counts.min-1/對(duì)照孔counts.min-1。六、腹腔巨噬細(xì)胞(macrophage, M)釋放HO功能測(cè)定按Nathan方法4：將貼壁M以RPMI-1640培養(yǎng)液制成2×10cells/mL的懸液，注入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(1 mL/孔)，在CO孵育箱內(nèi)37孵育20 h，取出后棄去上清液，以葡萄糖磷酸緩沖液(Krebs-ringer phosphate glucose, KRPG)沖洗細(xì)胞2次，然后每孔加入1.5 mL KRPG液，內(nèi)含莨菪葶、辣根過(guò)氧化物酶和十四酰佛波乙酸酯。孵育1

13、h，使用熒光分光光度計(jì)(MPE-4，Hitachi)測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)370 nm,發(fā)射波長(zhǎng)462 nm。另取6支試管分別加入分析純HO，使終濃度為1.25，2.5，5， 10，20和40mol/L，并測(cè)定熒光強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。七、統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以<"01.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s表示，均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果一、調(diào)肝方藥對(duì)應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能的影響應(yīng)激組大鼠血漿CORT、ACTH以及下丘腦CRH含量明顯高

14、于對(duì)照組(P0.05)，提示應(yīng)激可使大鼠HPAA興奮；而調(diào)肝方藥對(duì)HPAA的亢進(jìn)狀態(tài)有一定的抑制作用(P0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1調(diào)肝方藥對(duì)應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能的影響Tab 1The effect of TGFY on HPAA of stressed rat (<"01.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s,n=10)GroupCORT(ng/mL)ACTH(pg/mL)CRH(ng/hypothalamus)Cont

15、rol9.36±1.7249.3±10.22.34±0.81Stressed13.67±2.29?*92.2±18.9?*4.58±1.42?*Stressed+TGFY10.11±1.5651.4±9.72.47±0.45     ?*P0.01， vs control group; P0.05，vs stressed group 二、對(duì)應(yīng)激大鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響應(yīng)激組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯低于對(duì)照組(P0.01)；調(diào)肝方藥能提高應(yīng)激大鼠的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

16、，但未達(dá)到正常水平(P0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2調(diào)肝方藥對(duì)應(yīng)激大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響Tab 2 The effect of TGFY on spleen lymphocytes proliferative response of stressed rat （<"01.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s,n=10)GroupSpleen lymphocytes proliferativeresponse 3H-TdR (coun

17、ts*min-1)SIControl31 032±3 27610.8±4.3Stressed13 861±1 359?*4.6±1.6?*Stressed+TGFY27 221±2 1428.6±2.5     ?*P0.01，vs control gorup； P0.01，vs stressed group 三、調(diào)肝方藥對(duì)應(yīng)激大鼠腹腔M釋放HO功能的影響如1所示，應(yīng)激組大鼠M釋放HO量明顯低于對(duì)照組(P0.01)； 調(diào)肝方藥能明顯提高M(jìn)釋放HO的功能(P0.01)。見(jiàn)1。  

18、;   Fig 1The effect of TGFY on the release of HOfrom M (<"01.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s,n=10) ? P0.01, vs control group; P0.01, vs stressed group1調(diào)肝方藥對(duì)應(yīng)激大鼠腹腔M釋放HO功能的影響討論應(yīng)激是機(jī)體處于不利的內(nèi)外環(huán)境條件下所作的一系列反應(yīng)。國(guó)外已有研究證實(shí)情緒性應(yīng)激可以明顯影響機(jī)體的免

19、疫功能。應(yīng)激或心理防御機(jī)制的破壞與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)“正氣存內(nèi)，邪不可干”，其中正氣應(yīng)當(dāng)包括機(jī)體正常的神經(jīng)精神活動(dòng)，若情志活動(dòng)異常，則會(huì)影響到臟腑及氣血的功能而產(chǎn)生病變，即中醫(yī)所謂的“七情內(nèi)傷”。目前對(duì)應(yīng)激的研究多是從神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系來(lái)加以探討。1977年Besedovsky首先提出“神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)(neuroendocrine-immuuno-modulation, NIM)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)”，闡述了神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫的關(guān)系。在NIM網(wǎng)絡(luò)研究中，HPAA備受關(guān)注。糖皮質(zhì)激素、ACTH、CRH等是HPA軸的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，其中糖皮質(zhì)激素是HPA軸的終末產(chǎn)物?，F(xiàn)

20、已證實(shí)，糖皮質(zhì)激素(在大鼠主要為皮質(zhì)酮)對(duì)免疫功能的多個(gè)環(huán)節(jié)起抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用束縛制動(dòng)作為應(yīng)激原，復(fù)制應(yīng)激大鼠模型。當(dāng)大鼠受到束縛后，由于激怒，使得交感神經(jīng)興奮，神經(jīng)內(nèi)分泌可分泌CRH，促使ACTH的產(chǎn)生，此激素作用于腎上腺皮質(zhì)，使之分泌大量的糖皮質(zhì)激素，從而適應(yīng)應(yīng)激的需要。本實(shí)驗(yàn)觀察到應(yīng)激大鼠血漿CORT、ACTH以及下丘腦CRH含量升高，說(shuō)明HPAA興奮性升高，同時(shí)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)降低，提示束縛激怒應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能低下，血漿CORT的升高可能是抑制細(xì)胞免疫功能的主要原因。M是免疫系統(tǒng)中一類(lèi)重要的防御和調(diào)節(jié)細(xì)胞，其合成并釋放的活性氧物質(zhì)對(duì)微生物及腫瘤具有殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到應(yīng)激大鼠腹腔M釋放HO功能明顯下降，說(shuō)明應(yīng)激對(duì)M釋放HO具有抑制作用。結(jié)合應(yīng)激大鼠血漿CORT的升高，我們認(rèn)為這種抑制作用與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，這也可能是糖皮質(zhì)激抑制機(jī)體免疫反應(yīng)的機(jī)制之一。中醫(yī)認(rèn)為“怒傷肝”，而對(duì)情志活動(dòng)的異常則往往采用疏肝養(yǎng)肝之法。我們采用調(diào)肝方藥應(yīng)激大鼠進(jìn)行治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠HPAA興奮狀態(tài)可以被中藥復(fù)方所調(diào)整，大鼠細(xì)胞免疫功能的下降及腹腔巨噬細(xì)胞釋放HO功能的降低可被中藥復(fù)方所拮抗，說(shuō)明調(diào)肝方藥有效地參與了HPAA的調(diào)節(jié)，在總體上具有抑制HPAA的興奮性，促進(jìn)免疫機(jī)能的效應(yīng)，其機(jī)理可能與其激