殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗抗氧化酶的影響

1、殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗抗氧化酶的影響摘要：以“金棚錦秀”蕃茄幼苗為材料，采用噴灑不同濃度的殼聚糖溶液處理蕃茄幼苗的方法，測(cè)定水分脅迫下超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性以及蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，殼聚糖處理可提高水分脅迫下蕃茄幼苗的SOD、POD、CAT活性及蛋白質(zhì)含量。在一定濃度范圍內(nèi)(15、25、50、75 mg.L-1)蕃茄幼苗的抗旱性效果隨殼聚糖濃度的增加而增強(qiáng)。殼聚糖濃度為50 mg.L-1-75 mg.L-1之間時(shí)蕃茄幼苗的抗旱性達(dá)到最佳。由此可知，在水分脅迫條件下適宜濃度的殼聚糖可提高蕃茄幼苗的抗旱性機(jī)制可能是能夠清除活性氧、維持或提高SO

2、D、POD和CAT的活性。關(guān)鍵詞：殼聚糖；蕃茄幼苗；水分脅迫Effects of Chitosan (CTS) on Activities of Antioxidant Enzymeof Tomato Seedlings under Water StressXU Ting(School of biological Sciences, Huaibei Normal University)Tutored by CHEN ChuAbstract: To study the effects of chitosan on activities of protective enzyme in Gold s

3、hed Jinsiou tomato seedlings under water stress by measuring activities of super oxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) , catalase (CAT) and content of protein. The results showed that all groups significantly improved the activities of protective enzyme and content of protein. The effects of CTS o

4、n drought resistance of tomato seedlings may be related to concentration. The effect would be improved when the CTS concentration increased with in a certain rang (15,25,50,75 mg.L-1). The best concentration was between 50 mg.L-1 and75 mg.L-1. Therefore, the mechanism of CTS of appropriate concentra

5、tion that enhanced water stress may scavenge active oxygen species, maintains or increases the activities of SOD, POD and CAT. Keywords: chitosan; tomato seedlings; water stress目錄引言 . 11 材料與方法 . 11.1 實(shí)驗(yàn)材料 . 11.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 11.2.1 SOD活性的測(cè)定 . 21.2.2 POD活性的測(cè)定 . 21.2.3 CAT活性的測(cè)定 . 21.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 . 32 結(jié)果與分析

6、. 32.1 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中超氧化物歧化酶活性的影響 . 32.2 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中過(guò)氧化物酶活性的影響 . 32.3 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中過(guò)氧化氫酶活性的影響 . 42.4 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中蛋白質(zhì)含量的影響 . 43 討論 . 5參考文獻(xiàn) . 7致謝 . 8引言目前，水資源短缺是全球性環(huán)境問(wèn)題之一，干旱對(duì)農(nóng)作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位7。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)植物抗旱性的研究廣泛深入，植物抗干旱是與許多形態(tài)解剖和生理生化特性相關(guān)的復(fù)合遺傳性狀，其抗旱的機(jī)理十分復(fù)雜，不同形態(tài)解剖和生理特性之間既相互聯(lián)系又相互制約。單一的抗旱性

7、鑒定指標(biāo)不能充分反映出植物對(duì)干旱適應(yīng)的綜合能力，只有采用多項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，才能較準(zhǔn)確的反映植物的抗旱水平8。蕃茄是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)作物之一，水分脅迫對(duì)蕃茄的產(chǎn)量和品質(zhì)有極大的影響，因而增強(qiáng)蕃茄的抗旱性，提高蕃茄的產(chǎn)量和品質(zhì)勢(shì)在必行。要解決蕃茄的水分脅迫問(wèn)題，選用外源調(diào)節(jié)物質(zhì)是提高其抗旱性的重要途徑之一。殼聚糖（CTS），它也可以稱為脫乙酰甲殼素、甲殼胺，是由甲殼素脫乙?；@得的一種高分子物質(zhì)，即它是天然甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物。殼聚糖是一種天然的高分子物質(zhì)，它的許多結(jié)構(gòu)特性與纖維素相似，是一類氨基多糖。前人研究證明甲殼素可以從蟹殼、蝦殼等天然物質(zhì)中提取，蟹殼、蝦殼等廢料來(lái)源廣、價(jià)格低廉，將其

8、制成殼聚糖，無(wú)疑是一種廢物再利用的新的有效用途2。殼聚糖具有無(wú)毒、無(wú)害、安全可靠等特點(diǎn)，產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的第二大可再生資源，是自然界中唯一的天然堿性多糖，也是少數(shù)帶電荷的天然產(chǎn)物2。作為一種天然高分子材料，殼聚糖有許多特殊的功能和用途：其短鏈降解產(chǎn)物能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，提高植物幾丁質(zhì)酶活性，增強(qiáng)植物抗真菌病害的能力；殼聚糖還可用作多種糧食、蔬菜作物種子的處理劑，激發(fā)種子提前發(fā)芽；許多研究認(rèn)為它可以作為新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，增強(qiáng)作物抗病蟲(chóng)害能力，從而大大提高糧食和蔬菜的產(chǎn)量2。大量資料顯示，殼聚糖在飼料添加劑、土壤改良劑、種子處理劑等方面應(yīng)用廣泛。蕃茄的生長(zhǎng)、抗旱機(jī)制也越來(lái)越為人們所重

9、視。已有研究證實(shí)殼聚糖對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，如可以提高香蕉幼苗、黃瓜幼苗的抗冷性，改善小麥和油菜的抗病能力，且殼聚糖在醫(yī)藥、食品化工、生物化工等工業(yè)生產(chǎn)中也已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。但關(guān)于殼聚糖在提高蕃茄幼苗抗旱性上的效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。了解殼聚糖對(duì)植物的抗氧化酶產(chǎn)生的影響，進(jìn)行蕃茄抗旱方式的優(yōu)化，具有重要的實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖作為處理劑，以黃沙與蛭石的混合物作為栽培土壤，研究了不同濃度的殼聚糖溶液對(duì)蕃茄幼苗水分脅迫下抗氧化酶活性的影響，通過(guò)測(cè)定蕃茄幼苗保護(hù)酶的活性來(lái)探討水分脅迫條件下殼聚糖對(duì)蕃茄幼苗葉片中抗氧化酶的影響以及提高抗旱的可能性，以期為提高干旱、半干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益提供理論

10、及實(shí)踐依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料供試蕃茄品種為“金棚錦秀”。1.2 實(shí)驗(yàn)方法挑取粒大飽滿、生長(zhǎng)程度相似的200粒蕃茄種子放入溫度為56 的水浴鍋中保 1溫20 min以打破休眠，然后將種子勻播于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)，設(shè)晝25 ，14h/夜20 ，10 h，光強(qiáng)約為400 umol.S-2。在種子生長(zhǎng)過(guò)程中，每隔3 h滴加去離子水于培養(yǎng)皿中，使濾紙保持濕潤(rùn)，經(jīng)兩天蕃茄種子萌發(fā)出1cm左右的根，移栽入較小的育苗盤(pán)中，前期澆蒸餾水或1/2強(qiáng)度的霍格蘭特完全營(yíng)養(yǎng)液，后期澆霍格蘭特完全營(yíng)養(yǎng)液，待植株生長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，選整齊一致的蕃茄幼苗移入較大的育苗盤(pán)中。每盤(pán)4株，每天澆灌一

11、次霍格蘭特完全營(yíng)養(yǎng)液。植株生長(zhǎng)一個(gè)月后，挑選長(zhǎng)勢(shì)基本一致的12盤(pán)蕃茄幼苗植株，用小型噴霧器將不同濃度的殼聚糖溶液均勻噴到蕃茄幼苗的葉片上至欲滴為止，處理濃度分別為0（蒸餾水），15,25,50,75 mg.L-1，每天早晚各噴一次，正反面都噴，每次用量25 ml，連續(xù)噴灑七天，然后通過(guò)不給蕃茄幼苗澆灌霍格蘭特完全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行兩天的干旱處理，兩天后即可取蕃茄幼苗的倒二葉片測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。此試驗(yàn)中包括3個(gè)類別的處理：（1）正常水分，即每天只需正常澆灌一次霍格蘭特完全營(yíng)養(yǎng)液，作為正常對(duì)照（CK）（2）水分脅迫處理，即不澆灌霍格蘭特完全營(yíng)養(yǎng)液也不噴灑殼聚糖溶液，作為干旱對(duì)照（3）殼聚糖處理，殼聚糖濃度

12、分別為15、25、50、75 mg.L-1。以上處理均設(shè)兩個(gè)重復(fù)。稱取0.3 g葉片，加入5 ml預(yù)冷提取液（含50 mmol.L-1ph 7.0的磷酸緩沖液和1% PVP），在冰浴中研磨成勻漿，勻漿于4 下12000 rpm離心20 min,兩次離心后的上清液用于SOD、POD、CAT以及蛋白質(zhì)的測(cè)定。1.2.1 SOD活性的測(cè)定在3 ml反應(yīng)體系中，含有Met 13 mmol.L-1，NBT 75 umol.L-1，EDTA-Na2 10 umol.L-1、核黃素 2.0 umol.L-1，50 mmol.L-1ph 7.8 PBS，加入300 ul酶液，對(duì)照管以緩沖液代替酶液。混勻后，將

13、一支對(duì)照管置暗處，其他各管于4000 lx日光下反應(yīng)六分鐘。至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管作空白，分別測(cè)其它各管的560 nm吸光度。酶活按下列公式計(jì)算：SOD總活性=(Ack-AE)*V/(Ack*0.5*W*V1)SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量其中Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；V1為測(cè)定時(shí)樣品用量；W為樣品鮮重。1.2.2 POD活性的測(cè)定根據(jù)張志良的方法測(cè)定。先取300 ul酶液,再加入3 mlPOD反應(yīng)混和液后（注：攪勻），立即于470 nm下比色,磷酸緩沖液(pH=7.8)加3mlPOD反應(yīng)液作對(duì)照管，0秒計(jì)數(shù)，然后每隔30 s讀數(shù)，共計(jì)

14、3 min。酶活性以O(shè)D470nm.min-1.g-1FW表示。1.2.3 CAT活性的測(cè)定在3 ml反應(yīng)體系中，含0.3%的H2O2 1ml,H2O 1.9ml,最后加入150 ul酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，30 s計(jì)數(shù)。測(cè)定240 nm波長(zhǎng)處OD值的降低速度。每分鐘OD值降低0.01定 2義為1個(gè)酶活力單位。1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定按照Bradford的方法測(cè)定，取0.1 ml提取液放入具塞刻度試管，加入考馬斯亮藍(lán)G520蛋白，充分混勻，放置2 min后在595 nm波長(zhǎng)下比色，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查其含量，蒸餾水作空白樣。2 結(jié)果與分析2.1 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中超氧化物歧化酶活性的影響SO

15、D活性(U.mgProtein)25.0020.0015.0010.005.000.00CK015255075殼聚糖(mg.L-1)圖1 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中SOD活性的影響Fig.1 Effect of CTS on SOD activity of tomato seedlings leaves under water stress超氧化物歧化酶（SOD）是自然界唯一的以氧自由基為底物的酶，在活性氧代謝中處于重要地位，可猝滅超氧負(fù)離子的毒性，終止由超氧負(fù)離子啟動(dòng)的一系列自由基連鎖反應(yīng)造成的生物毒損傷，為生物體內(nèi)最重要的清除活性氧自由基的酶類。從圖1可以看出，CK的SOD活性很低，

16、干旱對(duì)照的SOD活性驟然升高，而殼聚糖濃度為15 mg.L-1、25 mg.L-1、75 mg.L-1的處理與干旱對(duì)照相比都能夠不同程度的降低SOD活性，SOD活性介于正常對(duì)照和干旱對(duì)照之間，對(duì)干旱起到一定的緩解作用，其中殼聚糖濃度為25 mg.L-1時(shí)SOD的活性最低，比干旱對(duì)照降低了50.49%,說(shuō)明這個(gè)濃度的殼聚糖對(duì)蕃茄幼苗干旱的緩解作用最好。2.2 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中過(guò)氧化物酶活性的影響3 -1Fig.2 Effect of CTS on POD activity of tomato seedlings leaves under water stress過(guò)氧化物酶（POD

17、）是植物體內(nèi)一類含血紅素的氧化酶，對(duì)逆境反應(yīng)較為靈敏，它催化由H2O2參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)，從而能氧化某些酚類、芳香胺和抗壞血酸等還原物質(zhì)2。從圖2可以看出，正常對(duì)照（CK）的POD活性最低，干旱對(duì)照的POD活性比正常對(duì)照升高11.89%，受水分脅迫處理的蕃茄幼苗葉片中的POD活性隨著噴灑的殼聚糖濃度的升高POD活性逐漸增加，分別比干旱對(duì)照上升了75.00%、119.58%、146.67%、161.46%。在0 mg.L-1與15 mg.L-1之間POD活性急劇上升，即清除活性氧的能力上升迅速，在15 mg.L-1與75 mg.L-1之間POD活性上升緩慢，在75 mg.L-1時(shí)POD活

18、性達(dá)到最大，清除活性氧的能力達(dá)到最大。2.3 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中過(guò)氧化氫酶活性的影響過(guò)氧化氫酶（CAT）也是植物機(jī)體在逆境中的保護(hù)性酶類蛋白之一，可以將H2O2分解成H2O和O2，從而減小活性氧對(duì)有機(jī)體的毒害，其活性高低是機(jī)體自我解毒能力的標(biāo)志2。從圖3可以看出，水分脅迫條件下蕃茄幼苗葉片的CAT活性降低，與CK相比,干旱對(duì)照的CAT活性降低了11.11%，經(jīng)過(guò)15 mg.L-1、25 mg.L-1、50 mg.L-1、75 mg.L-1的殼聚糖處理，蕃茄幼苗葉片中的CAT活性隨著殼聚糖濃度的增加而緩慢上升，與干旱對(duì)照相比，CAT活性分別上升了7.14%、8.04%、11.61%

19、、25.00%，CAT活性逐漸恢復(fù)正常水平，在75 mg.L-1時(shí)，CAT活性甚至超過(guò)CK的水平。經(jīng)過(guò)各個(gè)濃度的殼聚糖處理，水分脅迫下的蕃茄幼苗葉片中的CAT活性一直保持較高水平即具有較強(qiáng)的緩解作用，尤其是75 mg.L-1的處理時(shí)CAT活性達(dá)到最大。2.4 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中蛋白質(zhì)含量的影響植物在受到水分脅迫時(shí)，體內(nèi)常會(huì)積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，使植物保持一定的含水量和膨壓，以維持細(xì)胞正常的功能，可溶性蛋白質(zhì)就是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的一種。從圖4可以看出，正常對(duì)照的蛋白質(zhì)含量較高，干旱對(duì)照的蛋白質(zhì)含量比正常對(duì)照下降了 48.73%,經(jīng)各種濃度殼聚糖處理的水分脅迫下的蕃茄幼苗葉片中蛋白質(zhì)含量

20、呈波動(dòng)性上升，在25 mg.L-1時(shí)蕃茄幼苗葉片中蛋白質(zhì)含量最大，比干旱對(duì)照的蛋白質(zhì)含量上升了16.67%，對(duì)蕃茄幼苗的干旱起到的緩解作用最好。Fig.3 Effect of CTS on CAT activity of tomato seedlings leaves under water stress蛋白質(zhì)含量（ug.g-1FW） 300.00 250.00200.00150.00100.0050.000.00CK015255075殼聚糖(mg.L-1)圖4 殼聚糖對(duì)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of CTS on content of protein

21、of tomato seedlings leaves under water stress3 討論活性氧是植物正常代謝中的產(chǎn)物，在正常生長(zhǎng)條件下，活性氧的形成和清除保持 一種動(dòng)態(tài)平衡，逆境脅迫，如氣體污染、鹽漬和病害等可誘導(dǎo)活性氧自由基的產(chǎn)生和 積累，破壞這種平衡，SOD、POD、CAT正是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個(gè)保護(hù)酶，5三種酶協(xié)同作用，清除自由基，降低膜脂的過(guò)氧化。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)最重要的清除活性氧自由基的酶類，可猝滅超氧負(fù)離子的毒性，終止由超氧負(fù)離子啟動(dòng)的一系列自由基連鎖反應(yīng)造成的生物毒損傷?？寡趸富钚缘母叩?，對(duì)植物在脅迫條件下的抗逆能力有著重要的影響11。有研究證

22、實(shí)，殼聚糖能誘導(dǎo)水分脅迫下蕃茄幼苗葉片的SOD活性升高，緩解脅迫引起的氧化損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，僅受水分脅迫處理的蕃茄幼苗葉片的SOD活性比正常對(duì)照高出許多，經(jīng)過(guò)各種濃度殼聚糖處理的蕃茄幼苗葉片的SOD活性介于正常對(duì)照和干旱對(duì)照之間，且在25 mg.L-1時(shí)SOD的活性最低。因此，可以認(rèn)為，施加外源殼聚糖能夠有效緩解干旱引起的蕃茄幼苗的氧化損傷。過(guò)氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶類，對(duì)清除植物體內(nèi)過(guò)多的活性氧起到積極的作用?？寡趸富钚缘母叩?，對(duì)植物在脅迫條件下的抗逆能力有著重要的影響11。有研究證實(shí)，殼聚糖能誘導(dǎo)干旱脅迫下小麥幼苗葉片SOD、CAT、POD和APX等活性氧清除

23、酶的活性，降低膜質(zhì)過(guò)氧化作用，緩解脅迫引起的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)中，僅受水分脅迫處理的蕃茄幼苗葉片的POD活性比正常對(duì)照升高11.89%，受水分脅迫處理的蕃茄幼苗葉片中的POD活性隨著噴灑的殼聚糖濃度的升高POD活性逐漸增加，清除活性氧的能力也逐漸增強(qiáng)，在殼聚糖濃度為75 mg.L-1時(shí)，清除活性氧的能力最強(qiáng)，起到的緩解效果最佳。過(guò)氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶類，對(duì)清除植物體內(nèi)過(guò)多的活性氧起到積極的作用，主要負(fù)責(zé)清除植物體內(nèi)的活性氧的酶類11?？寡趸富钚缘母叩?，對(duì)植物在脅迫條件下的抗逆能力有著重要的影響11。在本實(shí)驗(yàn)中，僅受水分脅迫處理的蕃茄幼苗葉片的CAT活性比正常對(duì)照

24、降低了11.11%，受水分脅迫處理的蕃茄幼苗葉片的CAT活性隨著殼聚糖濃度的增加而升高，各個(gè)濃度處理的CAT的活性一直保持較高水平即具有較強(qiáng)的緩解作用，尤其是殼聚糖濃度為75 mg.L-1時(shí)，CAT活性最大甚至超過(guò)正常對(duì)照的水平。當(dāng)植物受到水分脅迫時(shí)，植物體內(nèi)常積累大量的游離脯氨酸、可溶性蛋白和糖，使植物保持一定的含水量和膨壓，以維持細(xì)胞正常的功能。本實(shí)驗(yàn)表明，殼聚糖處理使水分脅迫下的蕃茄幼苗葉片可溶性蛋白含量增加，在一定程度上能提高蕃茄幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，有助于蕃茄幼苗細(xì)胞或組織的持水，保證水勢(shì)下降時(shí)細(xì)胞膨壓得以維持，從而提高蕃茄幼苗的抗旱能力?？茖W(xué)家一直在尋找各自外源活性氧清除劑或活性物質(zhì)

25、，以減輕活性氧在水分脅迫中對(duì)植物的傷害，從而提高植物的抗旱能力。本研究表明，一定濃度的殼聚糖能夠明顯提高水分脅迫下SOD、CAT和POD活性，緩解水分脅迫對(duì)蕃茄幼苗的傷害，最終有效的提高蕃茄幼苗的抗旱能力。但是殼聚糖到底是作為信號(hào)物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)與抗旱有關(guān)酶的基因表達(dá)，還是直接作用于細(xì)胞膜系統(tǒng)，抑或是通過(guò)其他作用機(jī)理提高蕃茄幼苗的抗旱能力，對(duì)此還將做進(jìn)一步的研究。6參考文獻(xiàn)1 顧麗嬙,李春香,喬永旭等.外源CTS對(duì)干旱脅迫下黃瓜幼苗生理生化指標(biāo)的影 響.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,23(1):70-732 姜山,朱啟忠,張真豪.殼聚糖對(duì)小麥種子萌發(fā)及干旱脅迫下幼苗保護(hù)酶活性的 影響.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2011,29(1): 206-2093 王云,蔡漢,陸任云等.殼聚糖對(duì)鎘脅迫條件下小麥生長(zhǎng)及生理的影響.生態(tài)學(xué) 雜志,2007,26(10):1671-16734 從心黎,黃綿佳,馮妍等.外源殼聚糖對(duì)干旱脅迫下紅掌苗的生理效應(yīng).植物生 理學(xué)通訊,