桃過敏原蛋白nsLTP的基因多樣性和雙單抗夾心ELISA測定方法

1、桃過敏原蛋白nsLTP的基因多樣性和雙單抗夾心ELISA測定方法植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Non-specificLipidTransferProtein,nsLTPs)是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類堿性可溶性蛋白,約占植物體總蛋白的4%,分子量相對較小,存在于植物體的多個器官(胚、子葉、莖、葉、果實以及花器官)中，而圍繞植物器官的皮細胞和外周細胞、器官脫落區(qū)的nsLTPs含量最高。植物nsLTPs參與多個生物學(xué)過程，如細胞膜的形成、脂質(zhì)的定向轉(zhuǎn)運、角質(zhì)層的形成、胚胎形成、抗病、共生和適應(yīng)不良環(huán)境等。植物nsLTPs是一種泛過敏原,導(dǎo)致多種水果和花粉過敏,由于其蛋白家族高度保守的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)，

2、植物nsLTPs是導(dǎo)致不同水果之間以及水果和花粉之間交叉過敏的主要原因，如蘋果和桃，桃和蒿屬花粉等。桃(Prunuspersica(L.)Batsch)起源于中國西部地區(qū),我國的桃種資資源豐富,種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。桃是一類常見的水果致敏源,可引起較為嚴重的過敏反應(yīng)。在歐洲南部和中國北方地區(qū),非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白是桃過敏的主要過敏原。已有研究初步證明不同桃品種nsLTP的轉(zhuǎn)錄和表達存在差異。本研究分析了不同桃品種及桃近緣野生種nsLTPs基因多樣性和nsLTPs蛋白差異表達的原因，同時還調(diào)查了桃及桃近緣野生種的nsLTPs基因上游區(qū)段的核甘酸差異；利用桃重組蛋白rPrup3免疫小鼠，制備

3、得到7個抗桃nsLTP單克隆抗體，經(jīng)過鑒定和免疫活性測定,對其中的一個單抗(4-1)進行生物素標記,并以其作為檢測抗體,篩選出另一個單抗(B10-5)作為包板抗體，建立雙單抗夾心ELISA法，用以檢測桃果實中的Prup3含量；用建立的雙單抗夾心ELISA法測定了8個桃品種果皮和果肉中 Pru p3 的含量。主要研究結(jié)果如下：1.普通桃品種中nsLTPs基因非常保守，分析比對了47個普通桃品種的Prup3編碼核甘酸序列，未發(fā)現(xiàn)任何變異位點，普通桃的nsLTPs蛋白無序列差異。普通桃品種與三個桃近緣野生種（甘肅桃、山桃和光核桃）的nsLTPs基因存在較大差異，共發(fā)現(xiàn)18處變異位點，包括16處點突變

4、和2處缺失，其中有10處變異是在基因的第一個外顯子區(qū)域,另外8處在內(nèi)含子區(qū)域,第二個外顯子完全保守。根據(jù)這個基因的核苷酸變異位點數(shù)量,山桃與普通桃之間的差異比較大,山桃與普通桃之間的變異位點有12個,而光核桃和甘肅桃分別是5和4個。在氨基酸水平上,山桃與普通桃之間存在7個變異,包括位于信號肽區(qū)段的1個；甘肅桃與普通桃有兩個氨基酸差異,光核桃與普通桃僅有一個。分析薔薇科不同水果nsLTPs的進化關(guān)系,普通桃、甘肅桃和光核桃聚在一組,而山桃與扁桃聚在一起,屬于另一個組。2.分析桃和桃近緣野生種nsLTPs啟動子,得到三種單倍型upLTP1-a、upLTP1-b和upLTP1-c,三條序列之間存在2

5、4處單核苷酸變異位點,其中包括20處轉(zhuǎn)換,2處顛換和2處缺失。27個被測普通桃品種中,有13個品種含有upLTP1-c,9個品種含有upLTP1-a,而只有6個品種含有upLTP1-b,這6個品種均是雜合狀態(tài)，同時含有upLTP1-b和upLTP1-c,都來自于中國北方地區(qū)。在不同桃亞群中等位基因upLTPl-a、upLTP1-b和upLTP1-c的基因頻率不同。在“玉露”桃亞群中,upLTP1-a的基因頻率最高；而在“白鳳”亞群中,占主導(dǎo)地位的是upLTP1-c;在古老地方品種中，upLTP1-b和upLTP1-c的基因頻率比較接近,都較高；而在“白鳳”亞群中,等位基因upLTP1-b的基因

6、頻率只有0.086。三個桃近緣野生種光核桃、甘肅桃和山桃只含有等位基因upLTPl-b,與來源于北, 果皮中 Pru p3 的含量遠遠高于果肉中。方的地方老品種同源性較高。對啟動子區(qū)域進行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控元件如TATA-box和CAATbox,以及光響應(yīng)元件(AC-I,AE-box,G-box,GT1-motif,GAG-motif,SP-1,CG-motif和I-box等)，與植物非生物脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件(OBP-1site,AT-richsequence,TATC-box,MBS等)。3.以高純度的重組蛋白rPrup3免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過篩選獲得7株能夠穩(wěn)定分泌抗

7、rPrup3的雜交瘤細胞株：4-1,4-6,A7-1,A7-2,6-F7,11-B7和B10-5,經(jīng)效價測定分析,這7株單克隆抗體的效價分別是1：20000,1：10000,1：60000,1：20000,1：20000,1：20000和1：20000。經(jīng)過類型及亞型分析,7株單克隆抗體均屬于IgG類,4-1和4-6是IgG2a(kchain),其余5個是IgG1(kchain)。以重組蛋白rPrup3為抗原,以制備的單克隆抗體為一抗,通過Westernblotting鑒定單克隆抗體的抗體反應(yīng)性,結(jié)果表明這7株單克隆抗體均能有效地識別桃nsLTP。4.經(jīng)過特異性結(jié)合活性檢測和組合篩選,最終確定

8、一對單克隆抗體(4-1和B10-5),其中4-1(經(jīng)生物素化標記)作為檢測抗體,B10-5用作包板抗體建立雙單克隆抗體夾心ELISA檢測體系。測定結(jié)果表明該檢測方法具有較高精確度和準確度,重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好。特異性檢測結(jié)果顯示，抗體組合4-1和B10-5能夠與桃nsLTP進行特異性結(jié)合，與其他核果類如杏、李和櫻桃等nsLTP也能夠進行特異性結(jié)合，但結(jié)合活性遠遠低于與桃nsLTP的結(jié)合。5.用已知濃度的純化Prup3蛋白作標準品，利用已建立的雙單抗夾心ELISA方法測定8個桃品種果皮和果肉中Prup3含量，結(jié)果表明不同品種之間Prup3的含量存在較大差異,果皮中含量較高的品種是“紅珊瑚”，高達9.05