三種消化酶測(cè)定

1、蛋白酶活力的測(cè)定目的與原理掌握蛋白酶活力的測(cè)定方法，測(cè)定魚、蝦、貝等水產(chǎn)動(dòng)物主要消化器官肝胰臟、胃、腸等蛋白酶的活力。動(dòng)物消化器官內(nèi)含有各種消化腺，這些消化腺分泌消化酶進(jìn)行化學(xué)性消化作用，將機(jī)體攝入的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄孕》肿游镔|(zhì)而吸收進(jìn)入血液循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)采用福林酚法測(cè)定機(jī)體內(nèi)主要消化酶蛋白酶活力。福林酚試劑Folinphenol在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類化合物復(fù)原為藍(lán)色化合物。蛋白質(zhì)中含有酚基的氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，用蛋白酶分解酪蛋白底物，生成含酚基的氨基酸與福林酚試劑成藍(lán)色反響，可從藍(lán)色的深淺測(cè)知酶活力多少。試劑與器材試劑：1、福林試劑：在2000ml磨口回流裝置內(nèi)

2、參加鎢酸鈉Na2WO4·2 H2O100g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，水700ml，35磷酸50ml，濃鹽酸100ml，文火回流10小時(shí)，然后加人硫酸鋰50g，水50ml和溴水?dāng)?shù)滴，搖勻，去除冷凝器，繼續(xù)煮沸15分鐘，以除去多余的溴。溶液呈金黃色，冷卻后，定容至1000ml，過濾，濾液即福林試劑試劑不應(yīng)呈綠色，否那么需重配。置于棕色瓶中保存，使用時(shí)用氫氧化鈉標(biāo)定，稀釋至1N。2、0.55M碳酸鈉溶液3、10三氯乙酸4、0.02M pH7.5磷酸緩沖液：0.02M 磷酸氫二鈉溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412

3、H2O  7.164g)，溶解于1L蒸餾水中。0.02M 磷酸二氫鈉溶液的配制：取NaH2PO4 H2O  2.76g (或NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸餾水中。將0.02M 磷酸氫二鈉溶液84ml與0.02M 磷酸二氫鈉溶液16ml混合，即為0.02M pH7.5磷酸緩沖液。5、0.5酪素：酪蛋白0.5克，以0.5N NaOH 1ml濕潤(rùn)。再加少量0.02MpH7.5磷酸緩沖液稀釋。在熱水浴中溶解，定容至100ml，冰箱中可保存一周。材料：鮮活魚、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。器材：分光光度計(jì)、光徑1.0cm比色杯、離心管、電子天平、離心機(jī)、勻漿器、

4、剪子、鑷子、冰塊、試管假設(shè)干、移液管假設(shè)干。實(shí)驗(yàn)步驟1、酶粗提液的制備取新鮮肝胰臟、胃、腸組織稱重，在冰盤上剔除脂肪及內(nèi)容物，以10倍緩沖液或去離子水勻漿各組織，將組織懸液低溫下離心3000rpm/min,上清液為酶粗提液酶液。2、酶活力測(cè)定1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N鹽酸溶解，定容至100ml，分別配制溶液0100g/ml不同濃度溶液，不同濃度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5酪素2ml，于370C 水浴中反響15分鐘，然后參加三氯乙酸3ml，離心除去沉淀。取清液1ml，參加0.55M碳酸鈉5ml，再參加福林試劑1ml，于370C水浴顯色15分鐘，在680nm波

5、長(zhǎng)下比色，測(cè)光密度O D。以光密度讀數(shù)為縱坐標(biāo)，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線。2樣品測(cè)定樣品測(cè)定設(shè)對(duì)照管和測(cè)定管。                                對(duì)照管        

6、60;  測(cè)定管適當(dāng)稀釋酶溶液                    /                1ml去離子水           

7、             1ml                /                  370C水浴預(yù)熱3-5分鐘0.5酪素預(yù)熱過 &#

8、160;            2ml                 2ml                   370C水浴準(zhǔn)確反響15分鐘10三

9、氯乙酸                    3ml                3ml離心去除沉淀 取上清液于另外試管內(nèi)           &#

10、160; 1ml               1ml0.55M碳酸鈉                     5ml            

11、   5ml福林試劑                         1ml               1ml37水浴顯色15分鐘，680nm波長(zhǎng)比色，以對(duì)照管校零，讀取測(cè)定管光密度。3、計(jì)算在37

12、下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1g酪氨酸為一個(gè)酶活力單位蛋白酶的活力單位A/15×FA為樣品測(cè)得光密度查曲線，得相應(yīng)酪氨酸g數(shù)F 為酶液最終稀釋倍數(shù)，15為反響時(shí)間min方法評(píng)估福林酚法測(cè)定蛋白酶活力是生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究中應(yīng)用的根本實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)用意義水產(chǎn)動(dòng)物消化系統(tǒng)內(nèi)的消化酶隨動(dòng)物種類而異，而且消化酶的種類和在消化道中分布的差異是和動(dòng)物食性相適應(yīng)的。分析消化蛋白酶活力有助于了解動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)食物的消化能力，掌握動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求?？记绊氈?、實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)新鮮，不新鮮會(huì)發(fā)生組織自溶和酶原被破壞。2、酶液與底物作用時(shí)間、作用溫度要嚴(yán)格控制，否那么數(shù)據(jù)誤差很大。3、酶液要用適當(dāng)緩沖液稀釋到測(cè)定光密度在0.2

13、0.6之間。淀粉酶活力的測(cè)定目的與原理掌握淀粉酶活力的測(cè)定方法，測(cè)定水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的主要消化器官肝胰臟、胃、腸內(nèi)的淀粉酶活力。淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖等。在基質(zhì)充分的條件下，反響后參加的碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，其藍(lán)色深淺與未經(jīng)酶促反響的空白管比擬其吸光度，從而推算出淀粉酶的活力單位。試劑與器材試劑：1、0.04%可溶性淀粉精確稱取可溶性淀粉0.20g，置于20ml燒杯內(nèi)，參加蒸餾水約5ml，搖勻使成淀粉混懸液，另稱取無水磷酸二氫鈉13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml燒杯內(nèi)，參加蒸餾水約250ml,煮沸后，將淀粉混懸液倒入此燒杯內(nèi)，并用蒸餾水洗滌

14、裝淀粉混懸液的燒杯數(shù)次，洗滌亦倒入此燒杯內(nèi)。繼續(xù)煮沸1分鐘，冷卻至室溫后倒入500ml容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至500ml刻度。此淀粉液pH應(yīng)為7.0±0.1，在室溫下保存23個(gè)月。2、0.1N碘貯存液：精確稱取碘酸鉀(KIO3) 3.567g及碘化鉀KI45g置于1L容量瓶?jī)?nèi)，參加蒸餾水約800ml，然后緩慢參加濃鹽酸9ml，搖勻后用蒸餾水稀釋至1L刻度，置冰箱內(nèi)備用。3、0.01N碘應(yīng)用液：取0.1N碘貯存液50ml，用蒸餾水稀釋至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱內(nèi)約保存1個(gè)月。材料：新鮮魚、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。器材：分光光度計(jì)、電子天平、離心機(jī)、pH測(cè)定儀，恒溫水箱、勻漿

15、器、剪子、鑷子、冰塊、50ml比色管假設(shè)干、移液管假設(shè)干，500ml容量瓶，燒杯。實(shí)驗(yàn)步驟1、酶提取液的制備見實(shí)驗(yàn)蛋白酶活力的測(cè)定2、淀粉酶活力的測(cè)定取50ml刻度比色管二只，標(biāo)明為對(duì)照管，測(cè)定管。 對(duì)照管測(cè)定管0.04可溶性淀粉5.0ml5.0ml將兩管在37水浴中預(yù)熱25分鐘酶液0.1ml測(cè)定管混勻后，再置37水浴中反響7.5分鐘0.01N碘應(yīng)用液5.0ml5.0ml 用蒸餾水稀釋至50ml，立即混勻。用660nm或紅色濾光板進(jìn)行比色，以蒸餾水校正光密度0點(diǎn)，讀取對(duì)照管和測(cè)定管光密度讀數(shù)。3、計(jì)算淀粉酶活力單位定義：在370C、30min內(nèi)，100ml酶液中的淀粉酶能完

16、全水解淀粉10mg稱為一個(gè)淀粉酶活力單位。淀粉酶活力單位/100ml對(duì)照管光密度測(cè)定管光密度/對(duì)照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=對(duì)照管光密度測(cè)定管光密度/對(duì)照管光密度×800方法評(píng)估測(cè)定淀粉酶的方法有很多種，大致可分為兩類：即測(cè)定底物淀粉的減少量和測(cè)定產(chǎn)物如復(fù)原性糖的生成量。本實(shí)驗(yàn)采用前者的淀粉碘比色法。應(yīng)用意義分析淀粉酶的活力有助于了解水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)食物中淀粉的消化能力，由于魚蝦等水產(chǎn)動(dòng)物種類與大小的差異和所提供食物品質(zhì)的不同，以及動(dòng)物所處生活環(huán)境的變化，各種水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)食物的消化吸收有明顯的差異。認(rèn)識(shí)魚蝦消化酶變化特性，為研究水產(chǎn)種類飼

17、料配伍提供科學(xué)依據(jù)考前須知1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml內(nèi)含淀粉量為2mg，在本法條件下，當(dāng)2mg淀粉完全水解時(shí)相當(dāng)于800淀粉酶單位100ml即：2/10 × 30/7.5 × 100/0.1 = 800。2、對(duì)照管內(nèi)含淀粉2mg，由于淀粉溶液比擬穩(wěn)定，故對(duì)照管在固定比色計(jì)上的光密度讀數(shù)并不改變，因而在測(cè)定中不必每次作對(duì)照管。3、當(dāng)?shù)矸勖附咏?00單位時(shí)，由于淀粉已幾乎完全被水解，故參加碘液后也不再顯藍(lán)色，因此淀粉酶單位較高時(shí)接近600單位宜將標(biāo)本稀釋25倍后重新測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。4、如淀粉溶液出現(xiàn)混濁或絮狀物，表示淀粉溶液污染或變質(zhì)，不能再用。5、唾液

18、內(nèi)含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飛沫污染，也能使測(cè)定結(jié)果顯著偏高。脂肪酶活力的測(cè)定目的與原理掌握脂肪酶活力的測(cè)定方法，并測(cè)定魚、蝦、貝體內(nèi)消化器官肝胰臟、胃、腸的脂肪酶活力。脂肪酶在一定條件下，將甘油三酯水解。在不同水解階段可分別產(chǎn)生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所產(chǎn)生的脂肪酸可以用標(biāo)準(zhǔn)的氫氧化鈉滴定，用滴定值表示酶活力。試劑與器材試劑：1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄欖油乳化液：稱取40克聚乙烯醇，加蒸餾水約1000毫升，在小火上加熱，并不停攪拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷卻后定容至1000毫升。用雙層紗布過濾，濾液備用。取4聚乙烯醇溶液150毫升，加50毫升橄欖油，用高速組織搗碎機(jī)

19、攪動(dòng)6分鐘，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液，保存于低溫下4備用。2、0.025M磷酸緩沖液pH7.5。0.025M磷酸氫二鈉溶液的配置：取Na2HPO4·2H2O 4.45g溶于1L蒸餾水中，0.025M磷酸二氫鈉溶液的配置：取NaH2PO4·H2O 3.45g或NaH2PO4·2H2O 3.90g溶于1L蒸餾水中。將0.025M磷酸氫二鈉84ml與0.025M磷酸二氫鈉16ml混合，即為0.025M磷酸緩沖液。3、0.05N氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液4、1酚酞指示劑：取1g酚酞溶于100ml 70乙醇溶劑中。5、95乙醇材料：魚、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。器材： 勻漿器

20、、離心機(jī)、恒溫水浴。高速組織搗碎機(jī)、酸式滴定管、滴定管架、鑷子、剪子、錐形瓶、移液管、燒杯。實(shí)驗(yàn)步驟1、酶粗提液的制備見蛋白酶活力的測(cè)定。2、取100ml錐形瓶3個(gè)，一個(gè)作為對(duì)照組，另兩個(gè)為測(cè)定組                                  

21、60;       對(duì)照組      測(cè)定組1      測(cè)定組20.025M磷酸緩沖液pH7.5      5ml         5ml          5ml聚乙醇橄欖油乳化液  &

22、#160;          4ml         4ml           4ml95乙醇                  

23、0;               15ml                                     &#

24、160;      40水浴預(yù)熱510分鐘酶液                          1ml          1ml      

25、;    1ml                           40水浴保溫15分鐘精確計(jì)時(shí)95乙醇                                 15ml          15ml酚酞指示劑