柱色譜分離快與速柱層析

1、柱色譜分離及快速柱層析色譜柱色譜分離及快速柱層析色譜 Column Chromatographic Separation & Flash Chromatography杜亞偉杜亞偉1595292015-2016學(xué)年學(xué)年 現(xiàn)代分離工程現(xiàn)代分離工程 課堂匯報(bào)課堂匯報(bào)化學(xué)分離工程（化學(xué)工程二級(jí)學(xué)科）化學(xué)分離工程（化學(xué)工程二級(jí)學(xué)科）三級(jí)學(xué)科三級(jí)學(xué)科 蒸餾 吸收 萃取 吸附與離子交換 膜分離 蒸發(fā)與結(jié)晶 干燥 分離過程分類分離過程分類 有相產(chǎn)生或添加的分離過程 蒸餾、萃取、結(jié)晶、干燥 有分離介質(zhì)的分離過程 滲透、微濾、超濾、滲析 采用固體分離劑的分離過程 吸附、色譜分離、離子交換 有外加場(chǎng)的分離過

2、程 離心、電解、電泳、電滲析 色譜分離法分類色譜分離法分類按兩相狀態(tài)按兩相狀態(tài)氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜按分離機(jī)理按分離機(jī)理吸附色譜分配色譜離子交換色譜排阻色譜按固定相外形按固定相外形薄層色譜柱色譜紙色譜按分離效率按分離效率經(jīng)典液相色譜高效液相色譜色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不同而達(dá)到分離目的的。同而達(dá)到分離目的的。色譜流出曲線色譜流出曲線色譜流出曲線色譜流出曲線：由檢測(cè)器輸出的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線。色譜峰色譜峰：色譜流出曲線上突起部分?；€基線：色譜柱沒有樣品組分流出時(shí)的流出曲線。峰高峰

3、高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離。從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(1) 根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含 組分的最少個(gè)數(shù)；(2) 根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；(3) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(4) 色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；(5) 色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)。1.標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2.半峰寬半峰寬Y1/2:即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為 Y1/2=2.3543.峰底寬度峰底寬度Y:即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線

4、在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是 Y = 4 色譜分離中的重要參數(shù)色譜分離中的重要參數(shù)死時(shí)間死時(shí)間tM：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積。 因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相流動(dòng)速度相近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速時(shí)，可用柱長(zhǎng)L與tM的比值計(jì)算，即 = L/tM保留時(shí)間保留時(shí)間tR：試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過的時(shí)間，稱為保留時(shí)間。某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保留時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間 tR。 tR= tR tM 信號(hào)進(jìn)樣tMtRtR色譜分離的熱力學(xué)性質(zhì)色譜分離的熱力學(xué)性質(zhì) 分

5、配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次的分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次的吸附-脫附過程。 這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)K。它僅與兩個(gè)變量有關(guān)：固定相和溫度固定相和溫度。K = 溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度 = Cs / Cm 分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的物質(zhì)的量比。即k = 組分在固定相中的物質(zhì)的量組分在固定相中的物質(zhì)的量/組分在流動(dòng)相中的物質(zhì)的量組分在流動(dòng)相中的物質(zhì)的量 = ns / nm k

6、= ns / nm =CsVS / CmVmVm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積;Vs為柱中固定相的體積 對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：= tR(A) / tR(B) = k(A) / k(B)= K(A) / K(B) 通過選擇因子把實(shí)驗(yàn)測(cè)量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來，對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。 兩組分的兩組分的K K或或k k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。色譜分離的先決條件。塔板理論塔板理論 把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行

7、為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡(jiǎn)稱板高。 塔板理論假設(shè)：1. 在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H。2. 以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（Vm）。3. 所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。4. 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。理論塔板高度越低，在單位長(zhǎng)度色譜柱中就有越高的塔板數(shù)，則分離效果就越好。決定理論塔板高度的因素有：固定相的材質(zhì)、色譜柱的均勻

8、程度、流動(dòng)相的理化性質(zhì)以及流動(dòng)相的流速等。 塔板理論是基于熱力學(xué)近似的理論，在真實(shí)的色譜柱中并不存在一片片相互隔離的塔板，也不能完全滿足塔板理論的前提假設(shè)。塔板理論雖然能很好地解釋色譜峰的峰型、峰高，客觀地評(píng)價(jià)色譜柱地柱效，卻不能很好地解釋與動(dòng)力學(xué)過程相關(guān)的一些現(xiàn)象，如色譜峰峰型的變形、理論塔板數(shù)與流動(dòng)相流速的關(guān)系等。 塔板理論塔板理論速率理論速率理論 1956年荷蘭學(xué)者van Deemter吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。 van Deemter液液色譜方程： 簡(jiǎn)化方程為

9、： H = A + B / u + C u u為流動(dòng)相的線速度；A、B、C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。uDdDdDduDdHsfsmpsmmpmmp)(22222速率理論速率理論渦流擴(kuò)散項(xiàng)渦流擴(kuò)散項(xiàng) A 在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似渦流的流動(dòng)，故稱渦流擴(kuò)散。渦流擴(kuò)散。 由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長(zhǎng)短不一，因而同時(shí)進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱口時(shí)間并不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定： A = 2dp dp-填充

10、物的平均直徑的大小 -填充不規(guī)則因子有關(guān)分子擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng) B / u （縱向擴(kuò)散項(xiàng)）縱向擴(kuò)散項(xiàng)） 縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)的向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為 B = 2 Dg -彎曲因子，填充柱 1 空心柱 = 1 Dg-組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)速率理論速率理論 相對(duì)分子質(zhì)量大的組分Dg小，Dg反比于流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量的平方根，所以采用相對(duì)分子質(zhì)量較大的流動(dòng)相，可使B項(xiàng)降低； Dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。 另外縱向擴(kuò)散與組分在色譜柱內(nèi)停留時(shí)間有關(guān)，流動(dòng)相流速

11、小，組分停留時(shí)間長(zhǎng)，縱向擴(kuò)散就大。因此為降低縱向擴(kuò)散影響，要加大流動(dòng)相速度。速率理論速率理論傳質(zhì)阻力項(xiàng)傳質(zhì)阻力項(xiàng) Cu 對(duì)于液液分配色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)（C）包含流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cm）和固定相傳質(zhì)系數(shù)（Cs），即 CCmCs 其中Cm又包含流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力阻力，即 m是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子； sm是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。 液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（CsCs）可用下式表示：mpsmmpmmDdDdC22sfssDdC2快速柱層析色譜快速柱層析色譜- hi

12、gh-performance flash chromatography system 1978年W.C.Still等化學(xué)家提出了快速制備色譜這一概念，與傳統(tǒng)的柱色譜相比該技術(shù)在“一閃間”就可以完成分離純化，這就是flash一說的由來 Flash色譜的優(yōu)勢(shì)：省時(shí) 省力 省溶劑紫外檢測(cè)易判斷目標(biāo)產(chǎn)物 減少點(diǎn)板次數(shù)A-觸摸屏B-開關(guān)C-收集臂D-收集架E-收集托盤F-溶劑托盤G-色譜柱支架H-SNAP色譜柱I-檢漏器J-漏液托盤K-樣品裝卸泵快速柱層析色譜結(jié)構(gòu)快速柱層析色譜結(jié)構(gòu)-Biotage isolera為例為例Flash柱的選擇及上樣方式柱的選擇及上樣方式硅膠目數(shù) 100200, 200300

13、, 300400 規(guī)格 4g、12g、20g、40g、80g、120g etc. 硅膠柱選擇原則硅膠柱選擇原則 一般柱子最大載樣量為該柱子硅膠量的1/20，在實(shí)際的應(yīng)用中還應(yīng)根據(jù)各組份的分離程度和溶解性等來判斷具體的上樣量。 濕法上樣濕法上樣 一般樣品的溶解性較好時(shí)可以采用濕法上樣，濕法上樣具有方便損失少的特點(diǎn)。但必須注意濕法上樣的溶劑必須是淋洗劑中極性較小的溶劑或摻入百分比較少的極性溶劑，否則組份將很容易被洗脫下來。且溶劑量不宜超過柱體積的10%。干法上樣干法上樣 絕大多數(shù)的樣品我們都采用干法上樣，干法上樣所要注意的是，硅膠量和規(guī)格的選擇。硅膠量控制在是樣品的12倍，硅膠規(guī)格選擇上盡量和柱子

14、的目數(shù)一樣的200300的硅膠，切記當(dāng)樣品比較難以拌勻拌干時(shí)請(qǐng)選擇100200目硅膠，主要是因?yàn)楫?dāng)你拌樣硅膠越多時(shí)整個(gè)柱子的壓力就會(huì)上去，以免出現(xiàn)儀器過壓現(xiàn)象。Flash正相色譜正相色譜Rf值與柱體積關(guān)系值與柱體積關(guān)系 選擇極性和溶解性都較合適的展開劑，并使目標(biāo)產(chǎn)物的Rf值保證在0.150.3左右為最好。 左圖為某個(gè)組份點(diǎn)在某個(gè)Rf值出需要多少個(gè)CV（柱體積）的溶劑才能洗脫下來。 一般情況下我們?cè)趯?shí)際的flash應(yīng)用中應(yīng)用的柱體積都會(huì)多于這個(gè)數(shù)據(jù)，以保證產(chǎn)物的純度。RfCV0.91.10.81.30.71.40.61.70.52.00.42.50.33.30.25.00.110.0Flash反

15、相柱反相柱 反相原則反相原則 反相填料是在硅膠基質(zhì)上鍵合的諸如C4、C8、C18脂肪鏈的非極性填料。非極性或疏水性化合物被強(qiáng)烈保留，而極性樣品被弱保留，更快的通過柱床?！胺聪唷庇脕砻枋銎渖V過程與正相色譜正好相反。 流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 常用的流動(dòng)相為水和乙腈或水和甲醇，偶爾我們也會(huì)采用水和四氫呋喃。 在水相中我們一般都會(huì)滴加些弱酸弱堿，把整個(gè)體系調(diào)至偏酸偏堿，以保證組份能起峰。常用的弱酸弱堿是甲酸、三氟乙酸，氨水，碳酸氫銨等，所加的百分比一般與液質(zhì)體系相同。 反相樣品上樣反相樣品上樣 一般采用液相濕法上樣，常用溶劑包括水、甲醇、四氫呋喃、乙腈、NN-二甲基甲酰胺、二甲亞砜等。選擇最良溶劑

16、溶解，100mg樣品溶于1mL最佳。 以Biotage LS為例，最大壓力可達(dá)15bar，配備750g和1500g硅膠量的SNAP專用分離柱，最多一次可分離超過150g樣品；流速最高達(dá)到500mL/min，只需30分鐘就可以分離多達(dá)幾十克樣品。中試級(jí)快速制備色譜中試級(jí)快速制備色譜Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1利用利用flashflash柱層析色譜與反相高效液相色譜對(duì)微囊藻素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室級(jí)別純化柱層析色譜與反相高效液相色譜對(duì)微囊藻素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室級(jí)別純化C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173前言前言 微囊藻素是由水華藻

17、在淡水以及海洋環(huán)境中產(chǎn)生的一類肝毒素類環(huán)多肽結(jié)構(gòu)。其通過抑制真核細(xì)胞的蛋白磷酸酶在細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白合成、糖原代謝以及肌肉收縮等方面扮演重要角色。 高效薄層色譜與高電壓紙電泳僅能實(shí)現(xiàn)微囊藻素微克級(jí)別的提純。其難度在于微囊藻素僅占海藻細(xì)胞干重的0.7%，且其極性范圍較大。 該工作使用反相該工作使用反相flash柱從水華藻柱從水華藻細(xì)胞中提純克級(jí)的微囊藻素。細(xì)胞中提純克級(jí)的微囊藻素。微囊藻素結(jié)構(gòu)C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分（1）微囊藻素的萃?。┪⒛以逅氐妮腿?濃縮

18、的細(xì)胞浮渣物經(jīng)過甲醇萃取、離心、萃取、旋干除溶劑得提取物。 提取物通過flash柱以提取物:甲醇:水（1:1:1.8）洗脫劑進(jìn)行分離。（2）濃縮、純化微囊藻素）濃縮、純化微囊藻素 使用Biotage Flash 75 S system，壓力為137.8107 Pa，97.5 cm 色譜柱內(nèi)裝載兩種固定相：球形Hyperprep C18或不規(guī)則Bondapak C18填料。 流速：100 ml/min。 甲醇濃度0 - 100% 梯度洗脫。 238 nm分光光度計(jì)檢測(cè)。 HPLC進(jìn)行純度分析。（ 3）去鹽和濃縮）去鹽和濃縮Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1C. Edwards et al

19、. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1Microcystins are numbered and those previously characterised include 5=MC-LR. 8=MC-LY, 13=MC-LW and 14=MC-LF.C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1Absorbance (238 nm) of fractions eluted from (a) Hyperp

20、rep C18 and (b) Bondapak C18 using a step gradient with proportion of methanol in increments of 10%C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1根據(jù)各餾分成分，將餾分合并為3份。再用分析液相進(jìn)行檢測(cè)反相柱：Shandon Hyperprep

21、C18 流動(dòng)相：0.1%乙酸銨（A）,乙腈（B）檢測(cè)器：Waters 490檢測(cè)器，238, 214 和 254 nm三波長(zhǎng) Method 1: fractions eluted from the flash column which were found to contain more polar microcystins were pooled to give fraction 1. The components were separated with a mobile phase A-B (80:20).Method 2: flash fractions containing mainl

22、y MCLR (5) were pooled to give fraction 2. This was separated using a mobile phase A-B (78:22) with a step increase to 25% B after 12 rain to ensure elution of MC-LY (8).Method 3: fractions containing the hydrophobic microcystins were pooled and separated using a mobile phase A-B (76:24) with a step

23、 increase to 30% B after 8 min.C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash fractions were pooled to give three main fractions which were analysed by reversed-phase HPLC with diode-array detection: (a) fraction 1 containing predominantly an uncharacterised microcystin (2); (b) fracti

24、on 2 contained predominantly MC-LR (5) and MC-LY (8); (c) fraction 3 contained hydrophobic microcystins 12, 13, 14 and 15 and an uncharacterised microcystin (1).Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Analysis of purified MC-LR (5) by reversed-phase HPLC with diod

25、e-array detection showed a purity of 98%.Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-1制備液相進(jìn)一步分離制備液相進(jìn)一步分離C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-2利用Flash層析色譜進(jìn)行二乙烯三胺五乙酸（DTPA）中的乙脂成分的制備級(jí)分離J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336前言前言 DTPA是一種在放射性事故造成人體內(nèi)放射污染

26、時(shí)常用的促排劑。Ca-DTPA 和 Zn-DTPA被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入戰(zhàn)略國(guó)家儲(chǔ)備（Strategic National Stockpile）防止職業(yè)輻射、核能事故、潛在核彈危機(jī)造成的體內(nèi)放射污染。 臨床發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，注射DTPA和五取代-乙脂化DTPA（C2E5）的混合物可以降低50%肝臟钚含量；與兩種制劑獨(dú)立用藥，混合物提高了30%的效果?；贑2E5針對(duì)人群開發(fā)更為高效迅速的口服和經(jīng)皮滲透給藥途徑也被研究。 為了研究C2E5的酯鍵斷裂行為，需要不同DTPA不同酯化物的標(biāo)準(zhǔn)品。所謂該工作通過C18Flash對(duì)DTPA值化物進(jìn)行分離。Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-2Flash柱填

27、料柱填料：孔徑60 A、粒徑4060 m，230400目的C18 鍵合硅膠不同的酸性條件下的酯化：不同的酸性條件下的酯化：Reaction 1：大量制備C2E1Reaction 2：大量制備C2E2Reaction 3：反應(yīng)無鹽酸參與，其他條件同Reaction 2，大量制備C2E3和C2E4Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-2J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Reaction 1（A）和Reaction 2 （B）混合物HPLC分析，乙腈/水，有機(jī)相5%到95%線性梯度J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:3293

28、36Reaction 1和Reaction 2 混合物flash柱分離后C2E1(C)和C2E2(D)，洗脫劑乙腈:水=25:75J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Reaction 3 混合物HPLC分析，乙腈/水，有機(jī)相5%到95%線性梯度J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Reaction 3混合物flash柱分離后的C2E3(B)和C2E4(C)，洗脫劑乙腈:水=25:75J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-3Fitoterapia 82 (2011) 155161Flash柱分離應(yīng)用實(shí)例柱分離應(yīng)用實(shí)例-3比較Flash柱(0.1-10 bar