循環(huán)腫瘤細胞檢測的現(xiàn)狀及發(fā)展

1、循環(huán)腫瘤細胞檢測的現(xiàn)狀及發(fā)展李莉 -上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院檢驗科主任、主任醫(yī)師、博士生導師。美國匹茲堡大學醫(yī)學院（UPMC ）博士后。研究領域為臨床免疫學，主要方向為肥大細胞與疾病。獲得課題24 項其中國家自然科學基金8 項， 發(fā)表科研論文120 余篇，SCI 收錄 20 余篇。獲得上海市優(yōu)秀發(fā)明銀獎、華夏醫(yī)學科技獎二等獎和五洲女子科技獎基礎醫(yī)學創(chuàng)新獎。目前是上海市醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會主任委員，上海市醫(yī)師協(xié)會檢驗分會副會長，中華醫(yī)學會微生物和免疫學分會常委、中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會常委。惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移是臨床上實體惡性腫瘤治療失敗或復發(fā)的主要原因之一。而循環(huán)腫瘤細胞的存在正是實體惡性腫瘤遠

2、處轉(zhuǎn)移的根源。腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的最經(jīng)典依據(jù)是1889 年 Paget1 提出的“種子和土壤”學說， 該學說認為腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展，是處于活躍或活化狀態(tài)的腫瘤細胞作為“種子”， 當遇到適合的器官、組織的基質(zhì)環(huán)境，即“土壤”時， 就會在此定居、生長即發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而部分解釋了腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的關系。但原發(fā)部位的腫瘤（種子）是如何到達遠處器官或組織（土壤）的這一問題一直困擾著人們。直到 1869年，托馬斯阿什沃思（ThomasAshworth ） 2在1 例轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到了外周血循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells ， CTCs )從實體瘤中脫離出來并進入

3、血液循環(huán)的腫瘤細胞。他推測，這些細胞在癌癥轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了非常重要的作用，并可能提供疾病進展的相關信息，CTCs 的概念初步形成。據(jù)統(tǒng)計，90%以上的腫瘤病人死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)，實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞在特定條件下，通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化( epithelial-mesenchymal transition ， EMT ) ， 從形態(tài)上發(fā)生向間充質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力。間充質(zhì)細胞與上皮細胞相鄰，只是其結(jié)構(gòu)松散，缺乏細胞連接(celladhesion )和細胞極性，并且具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力。因此，脫落的 CTCs 得以進入外周血液循環(huán)，這是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提。脫離原發(fā)灶入血的CTCs

4、 至少面臨著血流剪應力、失巢凋亡、免疫細胞識別殺傷等三重致命考驗，進入循環(huán)的大部分腫瘤細胞都會失去活性，只有不足0.01% 可到達遠端器官，通過遷移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在適合的微環(huán)境條件下，CTCs 又發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化( mesenchymal -epithelial transition ， MET ) ，生成新的腫瘤，從而導致腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。從提出 CTCs 概念近一個多世紀的時間里，由于初期實驗條件、技術的限制以及學者對CTCs 的認識的局限性，CTCs檢測及臨床應用進展不大。直至上世紀末尤其是本世紀初，隨著分子生物學、計算機技術的發(fā)展，免疫標記技術以及分子生物學技術的突飛

5、猛進，CTCs 分離及分析鑒定技術得以迅速發(fā)展，CTCs 檢測和臨床應用取得了重大進步，為早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移、評估手術、放療、化學等療效、判斷預后、確定腫瘤分子特征、選擇合適的個體化治療等方面提供了重要的實驗室依據(jù)。目前，學者所共識的循環(huán)腫瘤細胞的概念是：自發(fā)或受外界因素作用（如診療操作等）由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶提供了可能。進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞大部分在機體免疫識別及殺傷等作用下發(fā)生凋亡，有極少數(shù)腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來，在一定條件下，進入血液循環(huán)而未被清除的腫瘤細胞通過遷移、黏附、 相互

6、聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶3。 本文擬就CTCs 分離技術、分析鑒定技術、臨床應用、CTCs 主要分析儀器作一介紹。1.循環(huán)腫瘤細胞分離富集技術越來越多的分子生物學和臨床研究結(jié)果表明，腫瘤轉(zhuǎn)移很可能在腫瘤發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)，在外周血中檢到CTCs 是預示腫瘤轉(zhuǎn)移最直接、重要的方法，在腫瘤早期轉(zhuǎn)移的臨床診斷、預后判斷、監(jiān)測療效等方面具有重要意義。CTCs 的發(fā)現(xiàn)有望改變臨床上仍依賴于影像學檢查及傳統(tǒng)腫瘤標志物的現(xiàn)狀。由于外周血中的CTCs 含量極為稀少，一般認為在外周血中大約105107 個單核細胞中才有一個CTCs4 ，因此，對CTCs 檢測技術的靈敏度和特異性提出了極高的

7、要求。目前各種CTCs 的檢測系統(tǒng)主要包括CTCs 分離和富集系統(tǒng)以及CTCs 的檢測和鑒定系統(tǒng)。而分離和富集系統(tǒng)對檢測外周血的CTCs 是非常必要的。理想的CTCs 分離與富集及檢測技術應能達到以下六點要求： （ 1 ）高捕獲率或高靈敏度，就是可以將樣品中的CTCs 盡可能多的分離出來，即至少能夠在上億個血循環(huán)細胞中發(fā)現(xiàn)一個腫瘤細胞；（ 2）高特異性，要求檢測結(jié)果準確無誤，盡可能降低假陽性或假陰性，目標是分離出來的細胞只有 CTCs ，其它細胞的含量很少或沒有；（ 3）要求CTCs不能被污染，收集到的CTCs 可以進行表型和基因型分析；（ 4） 高通量， 即能在短時間內(nèi)處理大量樣品；（ 5）

8、 重復性，回收率高。（ 6）盡可能降低成本5、 6。目前用于臨床實驗研究的CTCs 分離和富集技術非常之多，一般來講根據(jù)其物理性質(zhì)和基于親和性與識別的生物性質(zhì)以及兩者綜合利用可分成3 類。但目前來說仍沒有理想的方法，每種單獨的方法都有自己的優(yōu)勢和缺點。雖然兩種或三種方法的結(jié)合有可能成為較為理想的方法，但近十幾年的研究進展不大。1.1密度梯度離心法（Density Gradient Centrifugation ， DGC ）密度梯度離心的原理是基于血液中各種正常細胞與CTCs 密度的差別，利用其在密度梯度介質(zhì)（如Ficoll-Paque 介質(zhì)、OnceQuick 系統(tǒng)）中的沉降系數(shù)不同，將細胞

9、懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力的作用，用分離液將CTCs與其它細胞層分離。離心后在細胞分離液中各種細胞呈現(xiàn)梯 度分布，依次為：血漿成分、單個核細胞(淋巴細胞、單核細胞、腫瘤細胞等)、分離液、中性粒細胞和最下層的紅細胞， 從而獲取目標細胞。有報道用OnceQuick 系統(tǒng)分離腫瘤細胞得到了632 倍的富集效果，標明該系統(tǒng)對CTCs 的平均回收率高、富集效果好，而采用Ficoll-Paque 介質(zhì)只有3.8倍。 DGC 方法操作簡便、成本低，但該分離方法一般要求血量較大，且靈敏度和特異性均較低，且在操作過程中可能會損失 CTCs 。 1.2 細胞過濾技術(Isolation by Si

10、ze ofEpithelial Tumor Cells ， ISET )ISET 方法的原理是基于細胞大小不同和機械性能的差別。一般認為，腫瘤細胞的直徑為1530以mi,大于絕大多數(shù)血細胞的直徑(如紅細胞 59以m),根據(jù)細胞大小所設計的濾過膜濾過血液樣本后將直徑大的腫瘤細胞分離出來。但由于目前還沒有報道證實所有腫瘤細胞直徑都大于8以mi使其分離敏感性受到質(zhì)疑。該方法對技術、設備要求不高，但會丟失一小部分直徑小于濾膜孔徑的CTCs ， 導致檢測靈敏性降低。1.3 細胞粘附技術(Cell adhesion techniques ， CAT )細胞粘附分離技術是CTCs 捕獲的一項基本技術，利用的

11、是親和反應原理，即利用CTCs 與生物生化修飾或物理修飾捕獲表面的親和作用，含有CTCs 的樣本經(jīng)過捕獲表面時，CTCs 則被吸附在捕獲表面，隨后沖洗掉未被粘附的非目的細胞，從而得到CTCs 。此后發(fā)展起的多種納米及微流控技術都采用了這一基本技術。1.4 免疫磁珠分離技術( Immunomagnetic separation ， IMS )與普通血細胞相比，CTCs 具有某些特殊的生物標志物，包括 CTCs 表面的上皮細胞粘附分子( Epithelial cell adhesionmolecule ， EpCAM ) 、細胞角蛋白(Cytokeratin ， CK )以及腫瘤特異性抗原，而血液

12、中幾乎所有的細胞都是反磁性或弱磁性的，利用腫瘤細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，繼而在外加磁場中通過相應抗原抗體復合物與磁珠吸附而滯留在磁場中或定向移動到指定區(qū)域，沒有表面抗原的其它細胞由于不能與連接磁珠的特異性單克隆抗體結(jié)合而不能在磁場中停留，從而使腫瘤細胞得以從血液中分離出來7。 該方法的敏感性一定程度上受到CTCs 表面抗原表達的制約。例如：采用EpCAM 抗體捕獲CTCs ，由于 EpCAM 在 CTCs 的表達率一般為60-70% ，往往會丟失部分 CTCs ；單一的CK 抗體也不能完全識別癌細胞表達的所有 CKs ；在 CTCs 上皮間質(zhì)化過程中，一些基于標準化上

13、皮標志物的篩選抗體無法檢測出所有CTCs 等等。這一切都受到目標抗原的表達量與特異性以及與相應抗體的結(jié)合能力影響。 1.5 納米基質(zhì)分離技術( Nanoimprint matrix isolationtechnology )納米技術在納米尺度對檢測物質(zhì)進行檢測和操作，是一門融合化學、生物學、物理學和藥學的交叉學科。通過在基底表面制備納米結(jié)構(gòu)設計細胞界面，并修飾相應的特異性識別分子，可以將血液中的CTCs 捕獲并分離出來。陸寧寧等8綜述了據(jù)此思路研發(fā)的技術設備有：（ 1 ）納米柱、納米線及納米纖維：在CTCs 捕獲裝置中，納米柱、納米線及納米纖維基質(zhì)均可通過多種方式獲得。如利用濕法刻蝕或化學氣相

14、沉積法可制備納米柱或納米線基質(zhì)；（ 2）納米粗糙表面：由于 CTCs 的黏附性較血液中其它細胞強，所以粗糙界面的構(gòu)建為 CTCs 高效分離提供了另外一種選擇；（ 3） 碳納米材料：以碳納米管、石墨烯為代表的碳納米材料因具有高比表面積、優(yōu)良的導電性能和良好的生物相容性等特點，成為了生物傳感器、 儲能材料、藥物載體以及高分子等領域中的常用材料；（ 4）仿生材料：自然粒子如哺乳動物細胞和花粉，因具有獨特的拓撲結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)眾多優(yōu)良性能。以這些復雜結(jié)構(gòu)的自然粒子為模板，可制備具有相應結(jié)構(gòu)的仿生材料。相對于傳統(tǒng)的 CTCs 分離法的分類效率及特異性有了極大的提高，并且制備簡單，不需要復雜昂貴的微加工設備。1

15、.6 微流控芯片技術（Microfluidic chip technology ）微流控芯片技術（Microfluidics ）是把生物、化學、醫(yī)學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。微流控技術可在微米結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積液流，是近年來迅速崛起的集生物、化學、醫(yī)學、流體、電子、材料、機械等學科交叉的嶄新研究領域?；谖⒘骺匦酒腃TCs 分離技術通過在芯片通道內(nèi)部修飾可識別的細胞表面抗原的抗體或核酸適配體，當通入含CTCs 的樣本時，CTCs 與通道表面捕獲試劑結(jié)合，實現(xiàn)特異性分離。該方法所需樣品量小，無需對血液樣品進行前處理，

16、且流動的流體環(huán)境有利于去除非特異性吸附的其它細胞，從而提高分離純度。Dharmasiri等 9采用包被了EpCAM 抗體和抗-PSMA 核酸適配體的芯片從血液樣本中分離了不同的CTCs ，其捕獲率大于90% ，純度達到100% ，如將芯片通道中的平的捕獲表面用抗體修飾的納米結(jié)構(gòu)表面替代，CTCs 捕獲率甚至可以提高到95% 。微流控芯片是一個集樣品制備、反應、分離、檢測等功能于一體的小型分析實驗平臺。最早用于制作微流控芯片的材料主要是石英、玻璃及單晶硅片，隨著技術的進步，一系列有機聚合物如聚二甲基硅氧烷( Polydimethylsiloxane ， PDMS ) 、聚甲基丙烯酸甲酯(Poly

17、methylMethacrylate ， PMMA ) 、聚碳酸酯(Polycarbonate , PC)等材料已發(fā)展成為芯片制作的常用材料。目前根據(jù)微流控技術使用的原材料可分為基于硅材料的微流控芯片、基于 PDMS/ 玻璃的微流控芯片、基于熱聚膜的微流控技術(如PMMA ) 、基于微流控芯片平臺的磁分離技術、基于微流控芯片平臺的微納米基質(zhì)分離技術等7。除微流控芯片技術外，微流控技術( Microfluidics )還在其它循環(huán)腫瘤細胞分選富集方法中，取得了迅速發(fā)展。在微流控器件中從血液樣品注入到循環(huán)腫瘤細胞分選可以實現(xiàn)連續(xù)的過程，極大地簡化了操作程序，并可減少目標細胞的損失。黃笛等根據(jù)作用方

18、式將微流控分選富集技術分為被動分選和主動分選兩大類：被動分選技術包括微結(jié)構(gòu)過濾、場流及水力分選、確定性側(cè)向偏移、慣性分選、仿生分選、親和性分選等方法，一般具有通量高、不需要額外施加作用立場的優(yōu)點；主動分選技術包括介電泳分選、磁分選、聲分選、光分選等方法，一般具有分選精度高的優(yōu)點10 。 2.循環(huán)腫瘤細胞檢測技術經(jīng)過上述方法分選富集的CTCs 需要進一步分析鑒定，選用特異性的檢測技術或方法對CTCs 及其分子進行確認是循環(huán)腫瘤細胞檢測的重要步驟。常用的鑒定檢測技術包括免疫細胞化學技術(Immunocytochemistry ， ICC) 、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應 ( RT-PCR ) 、 熒光原位雜

19、交技術( Fluorescence In SituHybridization ， FISH ) 和流式細胞術( Flow Cytometry ， FCM )等。 2.1 免疫細胞化學技術(Immunocytochemistry ， ICC)是以顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和細胞化學呈色反應，對相應抗原進行定位、定性和定量的技術。目前選擇的循環(huán)腫瘤細胞的相關抗原包括EpCAM 、上皮角質(zhì)蛋白(CKs ) 、上皮細胞膜特異性抗原、腫瘤相關糖蛋白(TAG )或特異性標志物(如HER2 、抗乳球蛋白等)。其優(yōu)點在于腫瘤細胞膜未被破壞，可以進行后續(xù)研究，但此法敏感性低、檢測繁瑣、

20、易誤診。近年來研發(fā)出的光纖陣列掃描儀( Fiber scanning technology ， FAST ) 、激光掃描細胞計量儀(Laserscanning cytometry ， LSC ) 、自動細胞顯像系統(tǒng)(antomated cellular imaging system ，ACIS) 等， 使檢測系統(tǒng)有了很好的協(xié)同性，能完成高速掃描、準確定位免疫熒光標記的腫瘤細胞，有效提高了掃描熒光染色細胞的有效率和敏感性11 。雖然如此，腫瘤細胞表面抗原表達的不均一性，在一定程度上降低了檢測的敏感性。2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR )反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測CTCs 是基于組織或腫瘤特異性

21、mRNA 的表達或某些基因改變后DNA 水平的異常, 這些mRNA 不表達于正常外周血細胞，所以在外周血中檢測到特異 mRNA 可以間接提示CTCs 的存在。 RT-PCR 檢測 CTCs是在 PCR 基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA 序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA 片段，從而識別組織或腫瘤特異性mRNA 的表達或某些基因改變后RNA 水平的異常。這些mRNA 幾乎不表達于正常外周血細胞，所以在外周血中檢測到特異mRNA 可以間接提示 CTCs 的存在。目前，RT-PCR 的靈敏度已經(jīng)很高，在晚期癌癥患者的外周血中，RT-PCR 技術可以從每毫升血液中檢測到單個腫瘤細胞。Wang 等在乳腺癌中利用以KRT1

22、9 和 ERBB2 作為目的基因進行雙相RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，雙相RT PCR 檢測循環(huán)腫瘤細胞的敏感性比免疫細胞化學技術檢測要高，而且特別在早期乳腺癌尤為明顯12 。 但是，由于mRNA 的不穩(wěn)定性、取樣時上皮細胞的污染、腫瘤標志物在外周血的非正常表達以及假基因干擾等因素的影響，可致假陽性。同時該方法無法進行形態(tài)學觀察以及腫瘤細胞的定量限制了該技術的應用。2.3 流式細胞術( Flow cytometry ，F(xiàn)CM )是一項集激光、電子物理學、計算機、流體動力學、細胞免疫學等方法為一體的細胞分析技術。它利用腫瘤細胞單抗結(jié)合熒光物質(zhì)使腫瘤細胞染色，然后用流式細胞儀分析，染色細胞被視為陽性，大

23、致敏感性為1/105 。此技術可以對外周血樣本的CTCs 進行精確定量技術，并可以檢測細胞DNA含量。近來高通量FCM (如 Fishman-R microfluidic FCM )以及新腫瘤標志物(如EGFR 、磷酸化EGFR )的應用大大提高了流式細胞術的診斷效率13 。 2.4CTCs 芯片技術( CTCs-Chip )CTCs 芯片系統(tǒng)富集得到的CTCs 采用相同的分析方法，由于 CTCs 并不表達白細胞的共同抗原CD45 ，該檢測系統(tǒng)采用不同熒光標記的抗EpCAM 抗體、 抗 EGFR 抗體、 抗細胞角蛋白 CK-8 、 CK-18 和 CK-19 抗體以及核熒光染料DAPI作為陽性

24、指標，CD45 作為陰性指標?？稍?10 億以上血細胞檢測出單個癌細胞，敏感性非常高，并適用于所有類型腫瘤患者的外周血樣本。該方法大大提高了敏感性和從全血中捕獲稀少細胞的得率, 同時操作過程簡單溫和，從而使分離到的 CTCs 保持活力。目前第二代CTCs-Chip 技術（ Hchipherrin one chip） ， 不僅改進了該芯片構(gòu)造，使血液標本流經(jīng)芯片時形成微漩渦，增加了芯片表面包被抗體捕獲CTCs 的機會，更加有效捕獲數(shù)量極少的CTCs ，可捕獲血液中 90% 以上的癌細胞，而且該芯片還安裝了一個標準載玻片，可使用傳統(tǒng)病理檢查方法鑒別癌細胞14 。 3. 循環(huán)腫瘤細胞檢測的臨床應用循

25、環(huán)腫瘤細胞在原發(fā)腫瘤早期就可以發(fā)生并可以在外周血中檢測到，已經(jīng)開始用于腫瘤的輔助診斷。近年來，CTC 檢測在臨床上的應用使之成為了國際腫瘤分期系統(tǒng)的標準之一。 2007 年美國臨床腫瘤協(xié)會（ASCO ）首次將CTC 納入腫瘤檢測標志物15 。 CTCs 作為一種全新的腫瘤生物標志物，在疾病早期階段有助于良、惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤早期診斷、輔助診斷與腫瘤分期、判斷患者預后，治療過程中可用以進行療效監(jiān)測以及指導個體化治療。但必須認識到：自 2004 年美國強生公司Veridex 開發(fā)的 Cellsearch CTC 檢測技術獲得美國FDA 認證（準入應用于預測有轉(zhuǎn)移性的乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌

26、的無進展存活率和總存活率）以來，其它眾多廠家推出的循環(huán)腫瘤細胞檢測儀器都未獲得相關認證或準入，對惡性腫瘤的應用領域也未在更廣的腫瘤類型中獲得準入。目前，更多的報道尚處于臨床研究階段。但是， CellSearch CTC 檢測系統(tǒng)2015 年底已告停產(chǎn)的傳聞也從側(cè)面反映了為“腫瘤患者的科學算命”中“算命”的份量更重一些。乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，遠處轉(zhuǎn)移是主要的致死因素。CTCs的檢測對乳腺癌預后判斷、監(jiān)測病情和早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移等具有重要臨床意義。Biggers 等檢測了41 例早期乳腺癌患者，其中 10 例（ 24.4% ）在術前已可檢測到CTCs 。研究表

27、明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在治療前、治療中和治療后的CTCs 水平均與其預后密切相關，CTCs 可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者獨立的預后因子。有研究報道采用黏蛋白1 （ mucin 1 ， MUC1 ）和 CK19 共同作為檢測乳腺癌CTCs 的標志物，用 EPISPOT檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer ， MBC ）患者中 CTCs 分泌的 MUC1 ， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有被檢者的結(jié)果均為陽性，而健康人群中卻無法檢測得到。龔福生等的研究顯示，62例乳腺癌患者 CTCs的陽性率與TNM分期、Ki-67和HER-2 表達與否顯著相關，而與月經(jīng)狀態(tài)、ER 和 PR 表達與否無關16

28、。本研究在I 期患者中有1 例檢出 CTCs（ 16.7% ） ，提示癌細胞擴散可以出現(xiàn)在早期患者中。因此，檢測乳腺癌CTCs 有助于及早確定復發(fā)、轉(zhuǎn)移的高危患者，通過及時治療干預，可以阻止腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移。研究表明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在治療前、治療中和治療后的CTCs 水平均與其預后密切相關，CTCs 可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者獨立的預后因子。臨床上結(jié)直腸癌的CTCs 檢測主用是針對于上皮細胞EpCAM 標志以及標志物CKl9 、 CK20 、 CEA 等。研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 對結(jié)直腸癌早期診斷具有潛在的應用價值，在結(jié)直腸癌早期患者外周血中就能檢測到CTCs ， 提示 CTCs檢測對結(jié)直腸癌的診斷有

29、所幫助。CTCs 的存在與腫瘤原發(fā)灶分化程度無相關性，但與其臨床分期具有相關性。Sastre等 17 使用 CellSearch 系統(tǒng)檢測94 例大腸癌患者的外周血CTCs ,將CTCs>2個/7.5mL外周血定義為陽性，結(jié)果顯示陽性率為36.2（34/94） ， CTCs 陽性率與結(jié)腸癌的臨床分期相關（II 期 20.7 %,出期 24.1 %, IV 期 0.7%, P=0.005 ）。Cohen SJ 等研究認為CTCs 檢測的臨界值>3 個細胞最有價值， 成為治療前和治療中結(jié)直腸癌無進展生存時間（ PFS）和總的生存時間（OS ）的觀測指標18 。CTCs 在局限性

30、前列腺癌的臨床應用中目前仍存在一定爭議，但在進展和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床應用中得到廣泛認可。Danila 等 19對 120 例去勢抵抗性前列腺癌患者外周血采用cellSearch 系統(tǒng)進行 CTCs 檢測，發(fā)現(xiàn)基線CTcs 計數(shù)及化療過程中數(shù)目的變化與總生存期的關系；研究發(fā)現(xiàn)，99 例血樣（82）中檢測到CTCs，其中69例血樣（57%）基線CTCs計數(shù)A 5, 且治療前后CTCs計數(shù)均A 5的患者預后較差，治療后CTCs 計數(shù) <5 的患者有著相對較好的預后，說明 CTCs 計數(shù)及治療后數(shù)目的變化均是總生存期的獨立預后因素20 。 Onstenk等 21 研究發(fā)現(xiàn)，對去勢治療抵

31、抗性轉(zhuǎn)移性前列腺癌，在腫瘤治療的不同時間點，外周血CTCs 計數(shù)是其總存活率的較強的、獨立預后因素，而且作為早期標志物，CTCs 比傳統(tǒng)的血清 PSA 水平檢測更具優(yōu)勢。目前，傳統(tǒng)的血清學標志物如AFP 、 CAl9-9 、 CEA、 CAl25的聯(lián)合檢測不能早期反映腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，而CTCs 的特異性和敏感性均高于傳統(tǒng)方法。2004 年 Vona 等 22 首先利用ISET 法對 44 例肝細胞癌患者進行了CTCs 檢測的臨床應用的研究。 44 例患者中，有 23 例檢出了CTCs ， 檢出率為52% ，而在健康志愿者、慢性活動性肝炎及肝硬化患者中未檢出CTCs 。近來的研究表明，肝癌患者病

32、情狀態(tài)與血液中CTC的數(shù)量也顯示出極強的相關性。Sun 等 23對 123 例 HCC患者的 CTCs 研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 檢測可作為肝癌患者術后治療效果的監(jiān)測指標，并有望成為肝癌術后復發(fā)的獨立預測指標。 Labgaa 等 24總結(jié)了肝癌CTCs 相關文獻，認為外周血CTCs 與包括肝癌TNM 分期、 Okuda 分期、 BCLC 分期、Milan 分期在內(nèi)的肝癌分期呈正相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，外周血 CTCs 也與門靜脈癌栓、微血管癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移、術后復發(fā)有統(tǒng)計學相關性，與患者性別、年齡、有無肝硬化、乙肝表面抗原、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、腫瘤分化程度無關；手術前CTCs 陽性的患者術后腫

33、瘤復發(fā)的危險度較CTCs 陰性的患者顯著升高；且腫瘤預后與CTCs 數(shù)量有顯著關系，外周血中CTC 數(shù)目越多，患者的無病生存期（ Disease-free survival ， DFS ） 和總生存期（ Overall survival ，OS）越短，預后越差。肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷一直是困擾著臨床的難題之一。在早期肺癌（腫瘤直徑小于0.1cm ） ，其外周血中就可檢出CTCs ，可為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)及診斷提供重要依據(jù)。Allard等 25 采用 Cellsearch 系統(tǒng)檢測了99 例肺癌患者（大多為NSCLC ） 的 168 個樣品， 結(jié)果顯示，肺癌患者外周血中CTCs數(shù)目A 2>5

34、>> 10和A 50的患者分別占總患者的 20%、14%、 10% 和 6% ，平均 60% 的肺癌患者外周血中存在CTCs 。研究發(fā)現(xiàn)，外周血中循環(huán)腫瘤細胞存在以及數(shù)量與肺癌腫瘤分期具有相關性。Chen 等 26對 473 例 NSCLC 、 227 例良性肺部疾病以及56 例健康對照的CTCs 研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 組CTCs 水平明顯高于良性肺部疾病組，具有較高的敏感性（ 22.46% ）和特異性（88.65% ） 。與 Tanaka 等的研究發(fā)現(xiàn)一致，其對125 例肺部惡性腫瘤和25 例肺部非惡性腫瘤患者研究結(jié)果顯示肺部惡性腫瘤患者的CTCs 計數(shù)明顯高于非惡性腫瘤患者，并

35、且 SCLC 患者 CTC 計數(shù)顯著高于NSCLC患者，CTC計數(shù)隨著肺癌分期的增高而明顯增多，尤以IV期且伴遠處轉(zhuǎn)移的患者CTC 計數(shù)最高。也有研究發(fā)現(xiàn)CTCs水平隨腫瘤直徑增大、分化程度降低、骨轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而升高。Nagrath 等發(fā)現(xiàn)在評估化療的療效上，CTCs 數(shù)量的改變與按照實體瘤的療效評價標準(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors ， RECIST )進行計算機斷層掃描(computed tomography , CT)檢查的結(jié)果具有高度一致性。化療前 CTCs 計數(shù)高的患者預后差，化療后 CTCs計數(shù)下降多的患者，化療效果較

36、好，死亡風險降低，提示CTCs 對廣泛期的小細胞肺癌具有預測作用，并且化療后CTCs 計數(shù)的改變可以提供有價值的臨床信息，指導后續(xù)治療。 早期胃癌往往臨床癥狀不明顯，當出現(xiàn)明顯癥狀時，已到中晚期，失去了治療的最佳時機。因此早期診斷、治療胃癌是提高患者生存率的關鍵。CTCs 對胃癌特別是早期胃癌的發(fā)現(xiàn)及診斷目前尚處于探索和研究階段。李熳等對45例胃癌患者CTCs 進行了檢測，其中27 例(60% )檢出有CTCs ， CTCs 陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)密切相關，而與性別、年齡、腫瘤部位和TNM 分期、腫瘤分化程度無關 27 。 曹中正等于2014 年報道了運用免疫磁珠法陰性富集CTCs

37、并行免疫熒光原位雜交檢測技術28 。 41 例胃癌患者中 CTCs 陽性率為63.4% ， 24 例良性胃病(胃潰瘍或慢性胃炎)患者CTCs 陽性率為8.3% 。且發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中 CTCs 水平升高與TNM 分期無關，胃癌早期階段外周血中便可檢出CTCs ， 提示可能在腫瘤早期階段即發(fā)生微轉(zhuǎn)移。Hiraiwa 等利用 CellSearch System 發(fā)現(xiàn)外周血中 CTCs>2組總生存率顯著低于CTCs<2 組； Matsusaka 等人則發(fā)現(xiàn)CTCs>4組的化療病人總生存期和無進展生存期要顯著小于CTCs<4 組，提示CTCs 水平也許與化療藥

38、物治療反應相關。4.主要循環(huán)腫瘤細胞檢測儀器簡介美國 FDA 在 2004 年、 2007 年和 2008 年分別批準了美國強生公司子公司Veridex 開發(fā)的 Cellsearch CTCs 檢測技術用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌與前列腺癌的預后評估、無進展生存期和總生存期的預測。Cellsearch 也是目前唯一被FDA批準用于臨床的檢測系統(tǒng)。2007 年美國臨床腫瘤學會( American Society of Clinical Oncology ， ASCO ) 將 CTCs納入了腫瘤標志物范疇；2012 年國家食品藥品監(jiān)督管理總局( China Food and Drug Adminis

39、tration ， CFDA )批準Veridex 的 CellSearch 系統(tǒng)用于檢測CTCs 以評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預后；2013 年 CTCs 檢測被納入美國醫(yī)保；2016 年初 CFDA 批準了格諾思博生物科技有限公司自主研發(fā)的首個肺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測-葉酸受體陽性CTC 檢測試劑盒(注冊證編號：國械注準20163400061 ) 。該試劑盒采用了國內(nèi)原創(chuàng)的靶向PCR CTC 檢測技術，顯著提高了CTC 檢測的敏感性。自 2004 年， Cellsearch 檢測系統(tǒng)獲得美國FDA 的認證后，10 多年間 CTCs 檢測技術及檢測儀器突飛猛進，涌現(xiàn)了許多 專注于 CTCs 診斷的公司，

40、生產(chǎn)的檢測儀器品牌有四十幾種之多 29 ， 包括強生Veridex 公司、 凱杰公司 （ Qiagen ） 、 EpicSciences 、 CytoTrack 、 Codiak BioSciences 、 Illumina 、 Thermo Fisher 以及 Celsee Diagnostics 等等。以下簡介幾種作者認為較有代表性的CTCs 檢測儀器：4.1CellsearchCTCs 檢測系統(tǒng)Cellsearch CTCs 檢測系統(tǒng)是Veridex 公司 （ Veridex 公司是強生的一個子公司）專有的一項技術，是一種高效的、半自動化的 CTCs 檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用一種獨創(chuàng)的稱為鐵

41、磁流體的抗體，這種鐵磁流體可同鐵微粒相結(jié)合，且與CTCs 表面的 EpCAM /CK /CD45 等受體有極強的特異性結(jié)合的能力，系統(tǒng)用磁場將CTCs 分離之后進行生物或化學染色，細胞表面具有EpCAM /CK /CD45 被識別為腫瘤細胞。該系統(tǒng)包括三部分：細胞收集保存管：采集并完善保存細胞使樣 本可在室溫下保存小時，方便批量處理和遠途運輸；樣本 準 CellTracks? AutoPrep? 系統(tǒng)：采用自動化可復驗的樣本準備，可自動化樣本快速分析，以得到更精確的結(jié)果；樣本分析 CellTracks Analyzer II? 系統(tǒng)：可自動化樣本快速分析。 Cellsearch CTCs 檢測

42、系統(tǒng)既可以用于體外診斷也可供研究使用，同時將微量細胞進行分析的過程半自動化、標準化，使其成為一個簡單的三步流程。4.2Celsee PREPCelsee PREP 是美國 Celsee Diagnostics 公司生產(chǎn)的全自動循環(huán)腫瘤細胞富集和檢測平臺。其產(chǎn)品包括CTC 富集和檢測系列Celsee PREP100 、 Celsee PREP400 以及圖像分析儀 Celsee ANALYZER 。與其它免疫學與免疫磁珠、離心等富集分析方法不同，其而不依賴于特定的標志物，而是通過腫瘤細胞的物理特性來捕獲富集。在現(xiàn)有使用過濾方法富集 CTC 的產(chǎn)品中，Celsee 是第一個無需預先去除紅細胞、高度

43、自動化、高效率富集CTC 的產(chǎn)品，并將細胞富集系統(tǒng)與細胞鑒定和分析系統(tǒng)整合到一起。該系統(tǒng)能夠處理全血液樣本，不需要提前預處理。Celsee PREP400 利用微流體動力學，能實現(xiàn)多通道全自動化處理血液樣本，是多通道全自動的 CTC 富集和檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)從樣品到結(jié)果的一步到位。Celsee PREP 產(chǎn)品能在不添加標記、不依賴于特定標志物的情況下實現(xiàn)CTC 富集和回收，并能直接對富集的細胞進行免疫化學、DNA FISH 、或者 mRNA FISH 等實驗并能保證細胞活性。Celsee ANALYZER 的五色成像系統(tǒng)可對CTC特征、數(shù)量和細胞種類進行高度自動化、高通量的分析，以便研究人員更好地

44、理解癌細胞的突變和異質(zhì)性。4.3CytoQuestTM亞諾法 ( Abnova ) 30推出的 CytoQuestTM CR 是以分子親和力為基礎，利用對溫度敏感的奈米柱陣列捕捉及釋放循環(huán)腫瘤細胞( circulating tumor cells ， CTCs )的平臺。CytoQuestTM CR 能夠提供高純度、高存活率的循環(huán)腫瘤細胞 (CTCs) 以進行后續(xù)的蛋白質(zhì)生物標記(proteinbiomarker ）辨識及基因分析，如熒光原位雜交（FISH ） 、微陣列以及次世代測序技術（NGS ） 。對臨床醫(yī)學研究而言，CytoQuestTM CR 是一個威力強大的輔助工具，能夠幫助辨識與追

45、蹤癌細胞的變化和轉(zhuǎn)移。5. 循環(huán)腫瘤細胞檢測的展望早期準確地檢測CTC 對合理地進行綜合治療至關重要，并可作為治療效療評估指標及加強輔助化療的選擇性指標，有助于建立個體化治療方案。然而CTCs 是非常罕見的，只是血液中循環(huán)細胞的一小部分，因此除了計數(shù)以外的分子分析從技術上來說非常具有挑戰(zhàn)性。發(fā)現(xiàn)CTCs 生物學的全貌有助于靶定特異性細胞亞型，從而實現(xiàn)準確用藥和個性化治療的夢想。這不是一件容易的事，因為CTCs 不僅罕見，而且異質(zhì)性是腫瘤的基本特性。盡管目前在CTCs 研究方面已經(jīng)取得了很大的進步，但是多種分離富集與檢測方法仍難以滿足臨床實際工作的需要，每種技術的結(jié)果難以統(tǒng)一，理論和實踐上都需要

46、制定行業(yè)技術標準。如何進一步提高CTCs 檢測敏感性及特異性、發(fā)展適應臨床CTCs 快速診斷需要的高通量、自動化儀器、完善CTCs 檢測程序及標準化是今后研究的主要方向。CTCs 檢測的前景不僅僅在于其對腫瘤的診斷、治療、監(jiān)測，分選出的CTCs 對化療藥物敏感性檢測用于指導個體化治療是臨床亟需和期盼的。參考文獻1.Paget S. The distribution of secondary growthsin cancer of thebreast. 1889J. Cancer Metastasis Rev1989 ， 8（ 2） ： 98-101.2.Ashworth TR. A case

47、of cancer inwhich cells similar to those in the tumours were seen in theblood after deathJ. Aust Med J ， 1896 ， 14： 146-1493. 柳 直英，樊漪波，陳翼張，等. 循環(huán)腫瘤細胞的檢測技術及研究進展 J. 實用醫(yī)技雜志，2016， 23（ 1 ） ： 51-534.Sleijfer S ，Gratama J W ， Sieuwerts A M ， et al. Circulating tumour cell detection on its way to routine dia

48、gnostic implementation J. Eur. J. Cancer ， 2007， 43（ 18） ： 2645-2650.5. 劉代忠， 馮燮林，彭俊平.肝癌循環(huán)腫瘤細胞研究進展J.腫瘤預防與治療， 2014 ， 27（ 2） ： 92-976. 呂曉慶，李雷，陳紅梅，等.微流控芯片技術在循環(huán)腫瘤細胞分離中的研究進展J. 生物化學與生物物理進展，2015,42 （ 4） ： 301-3127. 林麗， 鄭磊 .微量循環(huán)腫瘤細胞檢測技術的研究進展J. 微循環(huán)學雜志 .2012 ， 22（ 4） ： 67-708. 陸寧寧，謝敏，程世博，等. 血液中循環(huán)腫瘤細胞捕獲與釋放方法研究進

49、展J. 分析科學學報， 2015 ， 31（ 3） ： 416-4269.Dharmasiri U ， Njoroge SK ， Witek MA et al. High-throughput selection, enumeration, electrokinetic manipulation, and molecular profiling of low-abundance circulating tumor cells using a microfluidic system. Anal Chem. 2011， 83（ 6） :2301-2309.10. 黃笛，項楠，唐文來，等. 基于微流

50、控技術的循環(huán)腫瘤細胞分選研究 J. 化學進展.2015,27（ 7） ： 882-91211.Li SP ， Guan QL ，Zhao D ， et al. Detection of Circulating Tumor Cells byFluorescent Immunohistochemistry in Patients withEsophageal Squamous Cell Carcinoma: Potential ClinicalApplications. Med Sci Monit ， 2016 ， 17（ 22） ： 1654-166212.Wang HY ， Ahn S ， K

51、im S ， et al. Detection of circulating tumor cells in patients with breast cancer using the quantitative RT-PCRassay for monitoring of therapy efficacy. Exp Mol Pathol. 2014： 97（ 3） :445-45213.UlrichH , T a rnok A.Flow cytometry detection of circulating tumor cells: achievements and limitations as p

52、rognostic parameters. Cytometry A. 2014， 85（ 3） ： 201-20214. 曹雅楠，莊文芳，盛慧明. 循環(huán)腫瘤細胞檢測技術及臨床應用J.中國實驗診斷學，2015 ， 19（ 7） ： 1223-122715.Harris L ，F(xiàn)ritsche H ， Mennel R ， et a1 American Society of Clinical Oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer J Clin Oncol ， 200

53、7 ， 25： 5287 531216. 龔福生，黃偉煒，劉健，等. 乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細胞檢測的臨床意義J. 中華腫瘤防治雜志，2015 ，22（ 13） ： 1009-101217.Sastre J ， Maestro ML ， Puente J ， et a1 Circulating tumor cells in colorectal cancer ： correlation with clinical and pathological variablesJ Ann Oncol ， 2008 ， 19（ 5） ： 935 93818. 劉平，魏子白. 結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細胞臨床應用進展J. 現(xiàn)代腫瘤