PCR試驗(yàn)室說明

1、PC骸驗(yàn)室設(shè)計(jì)PC骸驗(yàn)室分為四個區(qū)域，進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的工 作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出，四區(qū)域分別為： 1.試劑配制區(qū)n 2.樣品處理區(qū)n 3.核酸擴(kuò)增區(qū)n 4.產(chǎn)物分析區(qū)n如使用全自動分析儀，區(qū)域可 適當(dāng)合并，三四區(qū)可合并為擴(kuò)增產(chǎn)物分析。各區(qū)的功能是：1.1.1試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存。1.1.2樣品處理區(qū)：樣品 登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。1.1.3擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增產(chǎn)物的測定、結(jié)果分析、 登記及報(bào)告。1.2擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一定 的間隔。

2、1.3使用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進(jìn)行少量試劑配制。1.4在滿足下列操作和清 潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準(zhǔn)備區(qū)可設(shè)在同一房間內(nèi)：1.4.1在生物安全柜內(nèi)操作。 1.4.2每個實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)組分別使用各自的試劑及耗材。1.4.3盛放污染材料的器皿密封并 一次性使用。1.4.4用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行清潔及消毒。設(shè)計(jì)要求：PC骸驗(yàn)室可以是分散形式，也可以是組合形式，現(xiàn)要主要是以組合形式為主流。完成一組PCR 實(shí)驗(yàn)，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析四個實(shí)驗(yàn)過程，若實(shí)驗(yàn)工藝需要， 還應(yīng)增加樣品粉碎過程。一、分散形式PC雙驗(yàn)室所謂分散形式PC骸驗(yàn)室，是指完

3、成上述實(shí) 驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCRK驗(yàn)室，由于各 個實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。二、組合形式PC骸驗(yàn)室所謂組合形式PCR室，是指完成PCFffl個實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房相 鄰布置，組成獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)域的形式。對于組合形式PC雙驗(yàn)室，由于各個實(shí)驗(yàn)間集中布置，容 易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖問， 以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染，可以通過 控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散

4、出去污染試劑與樣品，可以通 過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。在理想情況下，PC雙驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室 內(nèi)。PC骸驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制，要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)，且高度為地面鋪裝 好后 2600mmt。如果使用熒光PCFT,擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PC時(shí)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖問 比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向 流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗(yàn)過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié) 果。實(shí)驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)

5、牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻 體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕 的要求。如果使用熒光PCFT,擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并。若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PC時(shí)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖問 比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向 流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗(yàn)過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié) 果。實(shí)驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻 體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光

6、潔、耐腐蝕 的要求。主要設(shè)備試劑準(zhǔn)備區(qū) 儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機(jī)等，加樣 器、天平除了要專用外，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。 試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使 用分子生物學(xué)級的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴(kuò)增效果。標(biāo)本制備區(qū) 儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機(jī)、溫育儀、混勻器等擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)的主要儀器是核酸擴(kuò)增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機(jī)、可移動紫外燈。擴(kuò)增 儀需進(jìn)行校準(zhǔn)。并配備UPSfe源，以防止由于電壓的波動，停電對擴(kuò)增效果的影響。分析區(qū)本區(qū)所使用的儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器和水浴箱等 潔凈實(shí)驗(yàn)區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主

7、實(shí)驗(yàn)室的八分之一，這是有規(guī)定的.1、主體結(jié)構(gòu)：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁, 從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。2、標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將PCFH程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCFT增，產(chǎn)物分析 四個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū) 通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PC雙驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和 環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū)I,緩沖區(qū)R和PCFT增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上 和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣

8、。3、消毒：在三個實(shí)驗(yàn) 區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。 在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū) 還設(shè)置移動紫外線燈，對實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。4、不銹鋼傳遞窗：試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖 不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人 物分流）。5、地面地面建議使用PVC材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐 腐蝕。6、照明 燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。 在建設(shè)的過程中應(yīng)注意： 規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。 嚴(yán)格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計(jì)的安裝流程。 安裝前需要 確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進(jìn)線位置，進(jìn)

9、水水壓，最小安 裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸 樣本處理區(qū)三、工作區(qū)域及設(shè)備要求（一）試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)1、2-8C和-15C冰箱2、混勻器3、微量加樣器（覆蓋1-1000u| 4、 移動紫外燈（近工作臺面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加 樣器吸頭（帶濾心）6、專用工作服和工作鞋7、專用辦公用品（二）標(biāo)本制備區(qū)1、2-8C冰 箱、-20C或-80C冰箱2、高速臺式冷凍離心機(jī)3、混允器4、水浴箱或加熱模塊5、微量加樣 器（覆蓋1-1000ul 6、可移動紫外燈（近工作臺面）7、生物安全柜8、消耗品：一次性手套 、一次性吸水紙、耐

10、高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 9、專用工作服和工作鞋10、 專用辦公用品如需處理大分子DNA,應(yīng)具有超聲波水浴儀。（三）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò) 增區(qū)1、核酸擴(kuò)增儀2、微量加樣器（覆蓋1-1000Ul 3、可移動紫外燈（近工作臺面）4、 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）5、專用工作服和工作鞋6、專用辦公用品（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)視檢驗(yàn)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如 下：1、微量加樣器（覆蓋1-1000u| 2、可移動紫外燈（近工作臺面）3、消耗品：一次性手 套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）4、專用工作服和工作鞋5、專用辦公用品5.人員 和樣品

11、的安全是由生物安全柜和定向氣流共同來保證。PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)規(guī)程中規(guī)定人員和樣品 必須單向流動。即從 試劑準(zhǔn)備區(qū)到樣品制備區(qū)，再從樣品制備走向擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)”，絕 對不能反向流動，以辭免交叉污染。氣流方向只規(guī)定試劑準(zhǔn)備區(qū)為微正壓或常壓，樣品制備區(qū) 為常壓或負(fù)壓，擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)為負(fù)壓，壓力梯度是從試劑準(zhǔn)備到產(chǎn)物分析區(qū)，是高到低 的。規(guī)程并沒有規(guī)定要做成全新風(fēng)系統(tǒng)，但是為降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，建議做成全新風(fēng)系統(tǒng)。1概述臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，是專門用來檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感 染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測出一些病毒 含量不高的感染

12、者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗(yàn)難以檢測出的 病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已 廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證絕 對安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的建 設(shè)越來越得到重視，因?yàn)樗鼘z測結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本文 主要從臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制和污染的防制幾個 方面對實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如 何避免污染。因此，實(shí)驗(yàn)室的平

13、面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞這個核心問 題進(jìn)行的。下面就對這幾個方面分別進(jìn)說明。2PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 室原則上分為四個單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和 擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行， 即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)-標(biāo)本制備區(qū)-擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)-擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖如圖1所示。 圖1 PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖3實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán) 格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)

14、域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形 式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。3.1試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 該 實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本 區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。3.2標(biāo)本制備區(qū) 該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng) 管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免?鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，

15、由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以 應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。3.3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為 DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反 應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中， 通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在 本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為 避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺 內(nèi)進(jìn)行。3.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

16、該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動封閉分 析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要 求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。 4污染的預(yù)防與控制 PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò) 增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染， 實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生 污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先 應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。4.1工作

17、區(qū)域的嚴(yán)格劃分（1）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；（2）各個實(shí) 驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備 物品、試劑等發(fā)生混淆。4.2合理的系統(tǒng)設(shè)置（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全 排的空調(diào)系統(tǒng)；（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。4.3規(guī)范的操作（1）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨 床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作；（2）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。止匕外，操 作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié) 束后，必須立即對本區(qū)進(jìn)行清潔

18、。除常規(guī)的消毒液體對表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消 毒外，對一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。4.4嚴(yán)格的管理（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人 員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個實(shí) 驗(yàn)區(qū)的門；（2）在各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員 離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；（3）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉 污染的可能性。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒 ,必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液 浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

19、（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物 質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。4.5完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保 證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工 作臺、離心機(jī)、加樣器等。PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全 送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。 3.1 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的 制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。 對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要 求。3.2標(biāo)