DNA提取與鑒定2‘

1、植物組織的植物組織的提取與鑒定提取與鑒定 張萍萍張萍萍分離純化核酸原則與要求分離純化核酸原則與要求1. 1.應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求要求) ) 2.2.排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染 純化的核酸樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑純化的核酸樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子的污染應(yīng)降低到最低程度；的污染應(yīng)降低到最低程度； 無(wú)其他核酸分子

2、的污染，例如提取無(wú)其他核酸分子的污染，例如提取DNADNA分子時(shí)，應(yīng)去分子時(shí)，應(yīng)去除除RNARNA分子分子3.3.減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解 避免過堿、過酸對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操避免過堿、過酸對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在作多在pH 4pH 41010條件下進(jìn)行條件下進(jìn)行4. 4. 減少物理因素對(duì)核酸的降解減少物理因素對(duì)核酸的降解 強(qiáng)烈振蕩、攪拌，將細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解、強(qiáng)烈振蕩、攪拌，將細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解、反復(fù)凍貯等造成的機(jī)械剪切力以及高溫煮沸等條件都反復(fù)凍貯等造成的機(jī)械剪切力以及高溫煮沸等條件都能明顯破壞大分子量的線性能明顯破壞大分子量

3、的線性DNADNA分子對(duì)于分子量小分子對(duì)于分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒的環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA及及RNARNA分子，威脅相對(duì)小一些分子，威脅相對(duì)小一些 。5. 5. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 細(xì)胞內(nèi)、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核細(xì)胞內(nèi)、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。DNADNA酶需要酶需要MgMg2+2+，CaCa2+2+的激活，因此的激活，因此實(shí)驗(yàn)中常利用金屬二價(jià)離子螯合劑實(shí)驗(yàn)中常利用金屬二價(jià)離子螯合劑EDTAEDTA，檸檬酸鹽，檸檬酸鹽，可基本抑制可基本抑制DNADNA酶的活性酶的活性 RNARNA酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸

4、酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸堿，不易失去活性，所以生物降解是堿，不易失去活性，所以生物降解是RNARNA提取過程的提取過程的主要危害因素。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好用新鮮生物組織主要危害因素。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好用新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮或一液氮或一7070的冰箱中。的冰箱中。DNADNA在細(xì)胞內(nèi)的分布在細(xì)胞內(nèi)的分布n核酸包括核酸包括DNADNA、RNARNA兩種分子，在細(xì)胞兩種分子，在細(xì)胞中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。n真核生物的染色體真核生物的染色體DNADNA為雙鏈線性分

5、子，為雙鏈線性分子，原核生物的染色體原核生物的染色體DNADNA、質(zhì)粒及真核細(xì)、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器胞器DNADNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNADNA為單鏈環(huán)狀分子；為單鏈環(huán)狀分子； 9595的真核生物的真核生物DNADNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其他其他5 5為為細(xì)胞器細(xì)胞器DNADNA，如線粒體、葉綠體等，如線粒體、葉綠體等 RNARNA分子主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占分子主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占7575，另有，另有1010在細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中，1515在細(xì)胞器中。在細(xì)胞器中。 大多數(shù)生物體內(nèi)大多數(shù)生物體內(nèi)RNARNA分子均為單鏈線性分子并具有不同分

6、子均為單鏈線性分子并具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核生物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核生物mRNAmRNA分子多數(shù)在分子多數(shù)在3 3端帶有端帶有polyApolyA結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 DNADNA的性質(zhì)的性質(zhì) DNADNA是很惰性的化學(xué)物質(zhì)，雙鏈由氫鍵緊密相連，其堿是很惰性的化學(xué)物質(zhì)，雙鏈由氫鍵緊密相連，其堿基對(duì)外側(cè)受磷酸和糖的保護(hù)，并由于其內(nèi)部的堿基堆積基對(duì)外側(cè)受磷酸和糖的保護(hù)，并由于其內(nèi)部的堿基堆積力而進(jìn)一步加強(qiáng)，使力而進(jìn)一步加強(qiáng)，使DNADNA在細(xì)胞內(nèi)比其他成分更具化在細(xì)胞內(nèi)比其他成分更具化學(xué)耐久性。學(xué)耐久性。 因此在氯仿等使蛋白質(zhì)變性的條件下，因此在氯仿等使蛋白質(zhì)變性的條件下，DNADNA分子仍然穩(wěn)定。分子仍

7、然穩(wěn)定。 真核生物中的染色體真核生物中的染色體DNADNA與堿性蛋白與堿性蛋白( (組蛋白組蛋白) )結(jié)合而成結(jié)合而成核蛋白核蛋白(DNP)(DNP)形式而存在于核內(nèi)。形式而存在于核內(nèi)。 DNADNA在乙醇中形成絮在乙醇中形成絮狀沉淀，使?fàn)畛恋?，使DNADNA最終得以分離最終得以分離真核生物基因組真核生物基因組DNADNA分離純化的基本步驟分離純化的基本步驟 真核生物的一切有核細(xì)胞真核生物的一切有核細(xì)胞( (包括培養(yǎng)細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞) )都可以用來(lái)都可以用來(lái)制備基因組制備基因組DNADNA。提取方法包括兩步：。提取方法包括兩步： 1 1、先溫和裂解細(xì)胞及溶解、先溫和裂解細(xì)胞及溶解DNPDNP，

8、再使核蛋白解離，再使核蛋白解離，釋放出釋放出DNA.DNA. 真核細(xì)胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、勻漿真核細(xì)胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、勻漿法、法、液氮破碎法、液氮破碎法、低滲法等物理方法及蛋白酶低滲法等物理方法及蛋白酶K K和和去污劑去污劑溫和處理法，為獲得大分子質(zhì)量的溫和處理法，為獲得大分子質(zhì)量的DNADNA，一般多采用后者，一般多采用后者溫和裂解細(xì)胞。溫和裂解細(xì)胞。高分子質(zhì)量高分子質(zhì)量DNADNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，長(zhǎng)而彎在物理上仍是易碎的，在溶液中，長(zhǎng)而彎曲的曲的DNADNA分子隨機(jī)卷曲，并因堿基堆積力和磷酸分子隨機(jī)卷曲，并因堿基堆積力和磷酸 基團(tuán)間基團(tuán)間的

9、靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、攪拌等引的靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、攪拌等引起的流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組起的流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組DNADNA容易成片容易成片斷獲取，但所需分子質(zhì)量越大，獲得的難度也相應(yīng)增加，斷獲取，但所需分子質(zhì)量越大，獲得的難度也相應(yīng)增加，大于大于150 kb150 kb的的DNADNA分子在常規(guī)分離方法中多被切斷。分子在常規(guī)分離方法中多被切斷。 去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提，反復(fù)抽提操作對(duì)去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提，反復(fù)抽提操作對(duì)DNADNA鏈機(jī)鏈機(jī)械剪切機(jī)會(huì)較多，因此有人使用械剪切機(jī)會(huì)較多，因此有人使用8080甲酰胺解聚核蛋白聯(lián)甲

10、酰胺解聚核蛋白聯(lián)合透析的方法，可得小于合透析的方法，可得小于200 kb200 kb的的DNADNA片段。片段。 RNaseRNase消化去除消化去除RNARNA2. 2. 采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNARNA及其及其他大分子他大分子小麥基因組小麥基因組DNADNA提取與鑒定提取與鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)植物基因組學(xué)習(xí)植物基因組DNA提取的原理。提取的原理。2熟悉并掌握基因組熟悉并掌握基因組DNA提取制備的基本技術(shù)。提取制備的基本技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】 脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNA）是一切生物細(xì)胞重要的組成）是一切生物細(xì)胞重要的組成成分，主要存在

11、于細(xì)胞核中，鹽溶法是提取成分，主要存在于細(xì)胞核中，鹽溶法是提取DNA的的常規(guī)技術(shù)之一。與動(dòng)物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞富含多常規(guī)技術(shù)之一。與動(dòng)物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞富含多酚、黃酮和多糖等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)易與酚、黃酮和多糖等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)易與DNA共沉淀而影響其分離純化。共沉淀而影響其分離純化。 CTAB法是目前植物基因組法是目前植物基因組DNA提取的首選方法，提取的首選方法，CTAB (十六烷三甲基溴化銨十六烷三甲基溴化銨)是一種陽(yáng)離子去污劑，是一種陽(yáng)離子去污劑，可使細(xì)胞膜破裂，并能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽可使細(xì)胞膜破裂，并能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（溶液中（0.5M NaCI）是可

12、溶的，通過離心使）是可溶的，通過離心使CTAB-核酸復(fù)合物與植物多糖等雜質(zhì)相分離。核酸復(fù)合物與植物多糖等雜質(zhì)相分離。核酸提取液中含有核酸提取液中含有的蛋白質(zhì)、多糖等可以的蛋白質(zhì)、多糖等可以用沉淀分離法除去。用沉淀分離法除去。在核酸提取液中加在核酸提取液中加入氯仿入氯仿- -異戊醇或氯仿異戊醇或氯仿- -辛醇，振蕩一段時(shí)間，辛醇，振蕩一段時(shí)間，使蛋白質(zhì)在氯仿一水界使蛋白質(zhì)在氯仿一水界面上形成凝膠狀沉淀而面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在離心除去，核酸仍留在水溶液中。水溶液中。 核酸都不溶于有機(jī)溶劑，可在核酸提取液中核酸都不溶于有機(jī)溶劑，可在核酸提取液中加入親水有機(jī)溶劑（乙醇或異丙醇），使加

13、入親水有機(jī)溶劑（乙醇或異丙醇），使DNADNA或或RNARNA呈絮狀沉淀析出。而呈絮狀沉淀析出。而CTABCTAB因溶因溶于乙醇或異丙醇而除去。于乙醇或異丙醇而除去。 植物基因組植物基因組DNADNA提取的另一種常用方法是提取的另一種常用方法是SDSSDS提取法，提取法，SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）是強(qiáng)去（十二烷基硫酸鈉）是強(qiáng)去污劑，可使細(xì)胞膜及核膜破裂，同時(shí)也是一污劑，可使細(xì)胞膜及核膜破裂，同時(shí)也是一種強(qiáng)的蛋白變性劑，使蛋白質(zhì)變性，與核酸種強(qiáng)的蛋白變性劑，使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從而從材料中提取出分離，從而從材料中提取出DNADNA。 【實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料】1 1材料材料小麥葉片小麥葉片2

14、 2器材器材研缽，恒溫水浴鍋，高速冷凍離心機(jī)，離心管，液氮罐研缽，恒溫水浴鍋，高速冷凍離心機(jī)，離心管，液氮罐 3 3試劑試劑(2(2人人/ /組組) ) (1) 1mol/L TrisHCl(1) 1mol/L TrisHCl緩沖液緩沖液(pH 8.0)(pH 8.0)：12.1g Tris12.1g Tris溶于溶于80mL80mL重蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)重蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pHpH至至8.08.0，用重蒸水定容，用重蒸水定容至至100mL100mL。 (2) 0.5mol/L EDTA(2) 0.5mol/L EDTA緩沖液緩沖液(pH 8.0)(pH 8.0)：?。喝?8.61g EDT

15、A-18.61g EDTA-Na2H2ONa2H2O用重蒸水用重蒸水80mL80mL溶解，然后用溶解，然后用NaOHNaOH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH至至8.08.0，加重蒸水至，加重蒸水至100mL100mL。 (3) PVP-10(3) PVP-10(聚乙稀吡咯烷酮聚乙稀吡咯烷酮) )【實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料】3 3試劑試劑(2(2人人/ /組組) )n(4)(4)氯仿氯仿- -異戊醇溶液異戊醇溶液(24:l ,V/V) (24:l ,V/V) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。，現(xiàn)配現(xiàn)用。n(5) 70%(5) 70%乙醇乙醇n(6) 1(6) 1TETEn(7)(7)無(wú)水乙醇或異丙醇無(wú)水乙醇或異丙醇n(8) RNase A

16、(8) RNase A (9) CTAB(9) CTAB提取緩沖液提取緩沖液(100ml)(100ml)1M Tris HCl (pH8.0) 10ml1M Tris HCl (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10mlNaCI 3.27gNaCI 3.27gPVP-10 1.0gPVP-10 1.0gCTAB 2.0gCTAB 2.0gddHddH2 2O O 定容至定容至 100ml100ml6565溶解，使用前加巰基乙醇溶解，使用前加巰基乙醇2ml2ml?！緦?shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料】 (10) SDS(10) SDS提取緩沖液提

17、取緩沖液(100ml)(100ml)1M Tris HCl (pH8.0) 10ml1M Tris HCl (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10mlNaCI 2.92gNaCI 2.92g偏重亞硫酸鈉偏重亞硫酸鈉 0.380.38SDS 1.25gSDS 1.25gddHddH2 2O O 定容至定容至 100ml100ml6565溶解，使用前加巰基乙醇溶解，使用前加巰基乙醇2ml2ml?！緦?shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料】【實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】1 1取取30ml30ml離心管中，加入約離心管中，加入約8ml SDS8ml SDS提取提取緩

18、沖液，水浴鍋中預(yù)熱至緩沖液，水浴鍋中預(yù)熱至6565，取，取2 24g4g新鮮葉片于研缽中，加人液氮充分研磨新鮮葉片于研缽中，加人液氮充分研磨成粉末，移入成粉末，移入30ml30ml離心管中（樣品的量離心管中（樣品的量為提取液量的為提取液量的1/2-2/31/2-2/3） 。充分混勻，置。充分混勻，置6565水浴水浴1h1h。每隔。每隔10-1510-15分鐘搖勻一次。分鐘搖勻一次。 2. 2. 取出，冷卻至室溫，加入取出，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿等體積的氯仿- -異戊醇溶液異戊醇溶液(24:l ,V/V) 12mL(24:l ,V/V) 12mL，上下劇上下劇烈振蕩烈振蕩1- 1-2min

19、2min （互溶即（互溶即可），可），使組蛋白分離，于使組蛋白分離，于4000r/min4000r/min，離心，離心l5minl5min，吸，吸出上面含有出上面含有DNADNA的水層，的水層，棄去兩層間的變性蛋白凝棄去兩層間的變性蛋白凝膠，回收下層有機(jī)相。膠，回收下層有機(jī)相?！緦?shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】 3. 3. 將上清液轉(zhuǎn)入另一將上清液轉(zhuǎn)入另一30ml30ml離心管中，在上清液中加入離心管中，在上清液中加入2 2倍倍體積冰無(wú)水乙醇或異丙醇，輕緩顛倒混勻，出現(xiàn)絮狀沉體積冰無(wú)水乙醇或異丙醇，輕緩顛倒混勻，出現(xiàn)絮狀沉淀，淀， -20-20放置放置30min30min或或-80-80放置放置10min1

20、0min。 4 4用槍頭鉤出用槍頭鉤出DNADNA或或4000 r/min4000 r/min離心離心15 min15 min，去上清液，去上清液，回收回收DNADNA沉淀。沉淀。 5 5沉淀用沉淀用7070乙醇洗滌乙醇洗滌1 1次。轉(zhuǎn)移至次。轉(zhuǎn)移至2mL EP2mL EP管中，晾干管中，晾干或在超凈工作臺(tái)上吹干?；蛟诔瑑艄ぷ髋_(tái)上吹干。 6 6吹干的吹干的DNADNA溶于適量的溶于適量的 TETE（0.2-1ml0.2-1ml）緩沖液中，完）緩沖液中，完全溶解后加入全溶解后加入10l RNase A10l RNase A，3737保溫保溫30 min30 min消化消化RNARNA?！緦?shí)驗(yàn)方法

21、實(shí)驗(yàn)方法】【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】 1 1研磨好的植物材料細(xì)粉末在轉(zhuǎn)入離心管之前不要讓它研磨好的植物材料細(xì)粉末在轉(zhuǎn)入離心管之前不要讓它融化。融化。 2 2提取過程中機(jī)械力可導(dǎo)致大分子提取過程中機(jī)械力可導(dǎo)致大分子DNADNA的斷裂，為保證的斷裂，為保證DNADNA的完整性，各步操作均應(yīng)較溫和，避免劇烈震蕩。液的完整性，各步操作均應(yīng)較溫和，避免劇烈震蕩。液氮研磨時(shí)，不宜過于劇烈；氮研磨時(shí)，不宜過于劇烈；除去蛋白質(zhì)時(shí)，若振蕩劇烈可除去蛋白質(zhì)時(shí)，若振蕩劇烈可使部分使部分DNADNA斷裂，乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的斷裂，乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的纖維狀纖維狀DNADNA外，溶液中還會(huì)有絮狀沉

22、淀，即為斷裂的外，溶液中還會(huì)有絮狀沉淀，即為斷裂的DNADNA。但若振蕩不夠，蛋白質(zhì)不能很好除去，則影響。但若振蕩不夠，蛋白質(zhì)不能很好除去，則影響DNADNA制品的質(zhì)量。制品的質(zhì)量。 3. 3. 為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，使其分子斷為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，使其分子斷裂，因而不能獲得天然的大分子核酸。提取中需要加人裂，因而不能獲得天然的大分子核酸。提取中需要加人EDTAEDTA、檸檬酸鈉檸檬酸鈉、8- 8-羥基喹啉等羥基喹啉等抑制核酸酶的活力抑制核酸酶的活力，并，并在在低溫低溫下進(jìn)行操作，此外提取過程中應(yīng)避免加熱，強(qiáng)酸，下進(jìn)行操作，此外提取過程中應(yīng)避免加熱，強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和

23、劇烈振蕩等。強(qiáng)堿和劇烈振蕩等。 4 4CTABCTAB或或SDSSDS溶液在低于溶液在低于1515時(shí)會(huì)析出沉淀，因此在時(shí)會(huì)析出沉淀，因此在加入冷凍的植物材料前必須預(yù)熱，離心溫度也應(yīng)保持不加入冷凍的植物材料前必須預(yù)熱，離心溫度也應(yīng)保持不低于低于1515。 5 5植物組織由于多酚類化合物含量較高，會(huì)使溶液出現(xiàn)植物組織由于多酚類化合物含量較高，會(huì)使溶液出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，如果材料中色素物質(zhì)特別多，可適當(dāng)提高抽褐變現(xiàn)象，如果材料中色素物質(zhì)特別多，可適當(dāng)提高抽提緩沖液中的巰基乙醇濃度至提緩沖液中的巰基乙醇濃度至2%2%5%5%，或增加，或增加PVPPVP的用的用量至量至2%2%；多糖含量太高的材料，可在使用前

24、將組織冷藏；多糖含量太高的材料，可在使用前將組織冷藏或冷凍保存?；蚶鋬霰４?。 為避免大分子為避免大分子DNADNA的斷裂，槍頭在使用前需圓口。的斷裂，槍頭在使用前需圓口?！咀⒁馐马?xiàng)注意事項(xiàng)】思考題1. 1.為什么在低溫下進(jìn)行？為什么在低溫下進(jìn)行？2. 2.加加EDTAEDTA或檸檬酸鈉的作用或檸檬酸鈉的作用 ? ?3. 3.加入異戊醇有什么作用？加入異戊醇有什么作用？4. 4.分離純化過程中每一步試劑的作用？分離純化過程中每一步試劑的作用？l實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)室： 207室室 209室室l領(lǐng)用儀器：領(lǐng)用儀器： 211室室l純水機(jī)：純水機(jī)： 207室室 209室室l離心機(jī)：離心機(jī)： 209室一臺(tái)室一臺(tái)

25、 103室一臺(tái)室一臺(tái)l分光光度計(jì)室：分光光度計(jì)室：108室室DNA的鑒定與分析紫外吸收法測(cè)定紫外吸收法測(cè)定DNADNA純度和含量純度和含量瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNADNA分子大小分子大小與完整性與完整性DNA的鑒定與分析紫外吸收法測(cè)定紫外吸收法測(cè)定DNADNA純度和含量純度和含量瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNADNA分子大小分子大小與完整性與完整性二苯胺顯色法測(cè)定二苯胺顯色法測(cè)定DNADNA含量含量紫外吸收法測(cè)定紫外吸收法測(cè)定DNADNA純度和含量純度和含量核酸在核酸在260nm260nm波長(zhǎng)處具有紫外吸收特性波長(zhǎng)處具有紫外吸收特性( (最大吸收峰最大吸收峰) )。此

26、法快速、。此法快速、簡(jiǎn)便，且不破壞樣品，是定量測(cè)定濃度較高的純簡(jiǎn)便，且不破壞樣品，是定量測(cè)定濃度較高的純DNADNA和和RNARNA溶液溶液的首選方法。的首選方法。高純度高純度DNADNA制品的制品的260nm260nm與與280nm280nm的吸光值的比值在的吸光值的比值在1.81.8左右左右，當(dāng)，當(dāng)比值偏高時(shí)表明制品中混雜有比值偏高時(shí)表明制品中混雜有RNA,RNA,而比值偏低時(shí)則表明制品中可而比值偏低時(shí)則表明制品中可能有蛋白質(zhì)或酚的污染。能有蛋白質(zhì)或酚的污染。因此，可利用因此，可利用A260/A280A260/A280比值的測(cè)定來(lái)鑒定比值的測(cè)定來(lái)鑒定DNADNA制品的純度制品的純度。【實(shí)驗(yàn)

27、原理實(shí)驗(yàn)原理】1 1取取DNADNA溶液溶液2ul2ul，用，用0.010.01mol/Lmol/L的氫氧化鈉溶液定容至的氫氧化鈉溶液定容至300ul300ul，轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入0.5mL0.5mL的石英比色杯中。的石英比色杯中。2 2用用300ul 300ul 0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH校正紫外分光光度計(jì)的零點(diǎn)。校正紫外分光光度計(jì)的零點(diǎn)。3 3在在260nm260nm，280nm280nm處分別讀出吸光度值處分別讀出吸光度值(A)(A)。定量分析：定量分析：DNADNA的濃度的濃度=A260=A260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù)505010001000 =A260 =A2

28、60150150505010001000 =7.5 =7.5A260(g/l)A260(g/l) RNA RNA的濃度的濃度=A260=A260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù)40401000 (g/l)1000 (g/l)【實(shí)驗(yàn)步驟】 分光光度換算：分光光度換算： 1A2601A260雙鏈雙鏈DNA=50g/ml DNA=50g/ml 1A2601A260單鏈單鏈DNA=30g/ml DNA=30g/ml 1A2601A260單鏈單鏈RNA=40g/mlRNA=40g/ml 注意 將DNA樣品稀釋到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之間再測(cè)A260、A280及計(jì)算A260/A280比值，因?yàn)?/p>

29、只有在此范圍內(nèi)才有線性關(guān)系，可先用原液測(cè)定，再估算稀釋比例。4 4純度分析：純度分析：若為若為DNADNA純品，則純品，則A260A260A280=1.8A280=1.8 若為若為RNARNA純品，則純品，則A260A260A280=2.0A280=2.0 若若DNADNA樣品樣品A260A260A2801.8A2801.8，說(shuō)明仍有，說(shuō)明仍有RNARNA，可用，可用RNARNA酶處理酶處理樣品；若樣品；若A260A260A280l.7A280l.7，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)再用酚，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)再用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀純化氯仿抽提，乙醇沉淀純化DNADNA。 若為若為RNAR

30、NA樣品樣品A260A260A2802.0A2802.0，也應(yīng)考慮再用酚，也應(yīng)考慮再用酚/ /氯仿抽提。氯仿抽提。 若核酸樣品若核酸樣品A260A260A2302.0A23010V/cm)(10V/cm)，所以選擇一個(gè)有，所以選擇一個(gè)有相對(duì)較大的緩沖槽比較有利。相對(duì)較大的緩沖槽比較有利?！咀⒁馐马?xiàng)注意事項(xiàng)】二苯胺顯色法測(cè)定二苯胺顯色法測(cè)定DNADNA含量（三）含量（三） 強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使DNADNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，脫氧核糖脫氧核糖與嘧啶核苷酸。與嘧啶核苷酸。 其中其中22

31、脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為羥基羥基酮基戊醛，酮基戊醛，此物與二苯胺反應(yīng)生成此物與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物藍(lán)色化合物，在，在595595nmnm處有最大吸收。處有最大吸收。DNADNA在在40-40040-400g/mlg/ml范圍內(nèi)光密度與范圍內(nèi)光密度與DNADNA濃度成正比。濃度成正比。 在反應(yīng)液中加入在反應(yīng)液中加入少量乙醛可提高靈敏度少量乙醛可提高靈敏度，而且其他化合物的干，而且其他化合物的干擾也顯著降低。擾也顯著降低。 當(dāng)樣品含少量當(dāng)樣品含少量RNARNA時(shí)不影響測(cè)定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生時(shí)不影響測(cè)定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有

32、色物質(zhì)，干擾測(cè)定。物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有色物質(zhì)，干擾測(cè)定?！緦?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】1 1、DNADNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液：（須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標(biāo)準(zhǔn)（須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標(biāo)準(zhǔn)DNADNA以以0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH配成配成200200微克微克/ /毫升的標(biāo)準(zhǔn)液。毫升的標(biāo)準(zhǔn)液。 每組需每組需1212.4ml.4ml，200ml/200ml/班班2 2、待測(cè)樣品液：待測(cè)樣品液：取取DNADNA溶液？溶液？ul ul，用，用0.010.01mol/Lmol/L的氫氧化的氫氧化鈉溶液定容至鈉溶液定容至5ml5ml配成配成100100微克微克/ /毫升的

33、溶液。毫升的溶液。 每組需每組需7ml7ml3 3、二苯胺試劑：、二苯胺試劑：1g1g二苯胺二苯胺 （需在（需在70%70%乙醇試劑中重結(jié)晶乙醇試劑中重結(jié)晶2 2次次) ) +100 mL+100 mL冰乙酸冰乙酸+10 mL+10 mL過氯酸，混合備用，過氯酸，混合備用，臨用前加臨用前加入入1.0 mL1.6%1.0 mL1.6%乙醛。乙醛。 每組需每組需64ml,1000ml/64ml,1000ml/班班4 4、1.6%1.6%乙醛：乙醛：取取47%47%乙醛乙醛3.43.4mlml，加重蒸水定容至加重蒸水定容至100100mlml（放于冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。放于冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。注意：商品用有注意：商品用有47%47%和和4 40%0%兩種兩種 1. 1. DNADNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定： 取取1 14 4支試管，分成支試管，分成2 2組，依次加入組，依次加入0 0、0.20.2、0.40.4、0.80.8、1.21.2、1.61.6和和2.02.0mlDNAmlDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。