光譜分析 (2)ppt課件

1、1 任務一、了解光學分析法基本知識 任務二、紫外可見分光光度法 實訓一、吸收曲線的繪制（721型光光度計手動繪制、UV1240自動繪制） 實訓二、吸光系數(shù)的測定（721型光光度計手動測定、UV1240自動測定） 實訓三、鄰菲啰啉顯色可見分光光度法測定水中微量Fe含量2 任務一、了解光學分析法基本知識 一、知識點： 1、光學分析法：以電磁輻射為測量信號,從而獲得物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)等定性或定量信息分析的方法。 2、分光光度法：利用待測物質(zhì)受到光的作用后，根據(jù)物質(zhì)對光的吸收程度不同，而對物質(zhì)進行定性或定量信息分析的方法。 3、光的性質(zhì) （1）電磁輻射（電磁波）：電磁輻射（電磁波）： 不需要任何物質(zhì)作傳播

2、媒介，以接近光速（在真空中為光速）傳播的能量。光是一種電磁不需要任何物質(zhì)作傳播媒介，以接近光速（在真空中為光速）傳播的能量。光是一種電磁輻射。輻射。 3*電磁輻射的基本性質(zhì)電磁輻射的基本性質(zhì) 電磁輻射具有波粒二象性：電磁輻射具有波粒二象性： 波動性：具有一定的頻率波動性：具有一定的頻率（HZ）、強度、速度，能透過物質(zhì)）、強度、速度，能透過物質(zhì) c = =/ 微粒性：微粒性： “光光” 因而叫光子，具有質(zhì)量，能產(chǎn)生光電效應。因而叫光子，具有質(zhì)量，能產(chǎn)生光電效應。 E = h = h c /射線等，因波長小，則能量大，為高輻射，微粒性突出射線等，因波長小，則能量大，為高輻射，微粒性突出 c：光速；

3、光速；：波長；波長；1nm=10-3m=10-6mm=10-9m ：頻率；頻率； （） ：波數(shù)：波數(shù) ； E ：能量：能量(eV)； h：普朗克常數(shù)：普朗克常數(shù)，4*電磁波譜：按各種電磁輻射的波長、頻率大小順序進行排列電磁波譜：按各種電磁輻射的波長、頻率大小順序進行排列 光學光譜區(qū)（中輻射區(qū)）波譜區(qū)（低輻射區(qū)）高輻射區(qū)5*4、電磁輻射與物質(zhì)的相互作用 (1) (1) 吸收吸收 多數(shù)物質(zhì)處于基態(tài)，當電磁輻射能恰好等于兩能級的能量差時，物質(zhì)就會選擇性數(shù)物質(zhì)處于基態(tài)，當電磁輻射能恰好等于兩能級的能量差時，物質(zhì)就會選擇性吸收特定頻率的輻射能，并從低能級躍遷到高能級；吸收的能量、頻率用由普朗克方程求得吸

4、收特定頻率的輻射能，并從低能級躍遷到高能級；吸收的能量、頻率用由普朗克方程求得 (2) (2) 發(fā)射發(fā)射 受激發(fā)的粒子通過弛豫可回到低能態(tài)或基態(tài)，同時將吸收的能量以光的形式釋受激發(fā)的粒子通過弛豫可回到低能態(tài)或基態(tài)，同時將吸收的能量以光的形式釋放出，產(chǎn)生發(fā)射光譜；放出，產(chǎn)生發(fā)射光譜； (3) (3) 散射散射 丁鐸爾散射和分子散射；丁鐸爾散射和分子散射； (4) (4) 折射折射 折射是光在兩種介質(zhì)中的傳播速度不同；折射是光在兩種介質(zhì)中的傳播速度不同； (5) (5) 反射反射 (6) (6) 干涉：干涉： 干涉現(xiàn)象；干涉現(xiàn)象； (7) (7) 衍射：衍射： 光繞過物體而彎曲地向他后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象

5、；光繞過物體而彎曲地向他后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象； (8) (8) 偏振：偏振： 只在一個固定方向有振動的光稱為平面偏振光。只在一個固定方向有振動的光稱為平面偏振光。 6*5、原子光譜與分子光譜、原子光譜與分子光譜 分子光譜復雜，光譜圖呈帶狀，電子躍遷時帶有分子振動和分子轉(zhuǎn)分子光譜復雜，光譜圖呈帶狀，電子躍遷時帶有分子振動和分子轉(zhuǎn)動能級躍遷；動能級躍遷； 原子光譜簡單，為線狀光譜，由原子內(nèi)、外層電子躍遷產(chǎn)生。原子光譜簡單，為線狀光譜，由原子內(nèi)、外層電子躍遷產(chǎn)生。 7（）原子發(fā)射光譜（）原子發(fā)射光譜（AES）；）； 以火焰、電弧、等離子炬等作為光源，使氣態(tài)原子的外層電子受激發(fā)射出特征光以火焰、電弧、等離子

6、炬等作為光源，使氣態(tài)原子的外層電子受激發(fā)射出特征光譜進行定量分析的方法。譜進行定量分析的方法。原子光譜原子光譜 （）原子吸收光譜（）原子吸收光譜（AAS）：基于原子外層電）：基于原子外層電子躍遷；子躍遷； 利用特殊光源發(fā)射出待測元素的共振線，并利用特殊光源發(fā)射出待測元素的共振線，并將溶液中離子轉(zhuǎn)變成氣態(tài)原子后，測定氣態(tài)原子將溶液中離子轉(zhuǎn)變成氣態(tài)原子后，測定氣態(tài)原子對共振線吸收而進行的定量分析方法。對共振線吸收而進行的定量分析方法。8（）原子熒光分析法（）原子熒光分析法（AFS）：）： 氣態(tài)原子吸收特征波長的輻射后，外層電子從基態(tài)或低能態(tài)躍遷到高能態(tài)，在氣態(tài)原子吸收特征波長的輻射后，外層電子從基

7、態(tài)或低能態(tài)躍遷到高能態(tài)，在10-8s后躍回基態(tài)或低能態(tài)時，發(fā)射出與吸收波長相同或不同的熒光輻射，在與后躍回基態(tài)或低能態(tài)時，發(fā)射出與吸收波長相同或不同的熒光輻射，在與光源成光源成90度的方向上，測定熒光強度進行定量分析的方法。度的方向上，測定熒光強度進行定量分析的方法。（）（）X射線熒光分析法（射線熒光分析法（XFS）：）： 基于原子內(nèi)層電子躍遷的原子受高能輻射，其內(nèi)層電子發(fā)生能級躍遷，發(fā)射出特基于原子內(nèi)層電子躍遷的原子受高能輻射，其內(nèi)層電子發(fā)生能級躍遷，發(fā)射出特征征X射線（射線（ X射線熒光），測定其強度可進行定量分析。射線熒光），測定其強度可進行定量分析。9分子光譜（為帶狀光譜）：分子光譜（

8、為帶狀光譜）： （）（） 紫外光譜法（紫外光譜法（UV）；）；（）紅外光譜法（）紅外光譜法（IR）；）；（）分子熒光光譜法（）分子熒光光譜法（MFS）；）； （）分子磷光光譜法（）分子磷光光譜法（MPS）；）；（）核磁共振與順磁共振波譜（）核磁共振與順磁共振波譜（N） 分子吸收光譜的產(chǎn)生：分子吸收光譜的產(chǎn)生： 基于分子中電子能級、振動、轉(zhuǎn)能級躍遷產(chǎn)生?；诜肿又须娮幽芗?、振動、轉(zhuǎn)能級躍遷產(chǎn)生。（1）物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動形式：）物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動形式： 電子運動：原子核外電子相對于原子核的運動；電子運動：原子核外電子相對于原子核的運動； 振動：原子核在其平衡位置附近的相對振動；振動：原子核在其

9、平衡位置附近的相對振動； 轉(zhuǎn)動：分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動。轉(zhuǎn)動：分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動。（2）分子具有三種不同能級：）分子具有三種不同能級： 電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。三種能級都具有相應的能量。電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。三種能級都具有相應的能量。 分子的內(nèi)能電子能量分子的內(nèi)能電子能量Ee +振動能量振動能量Ev +轉(zhuǎn)動能量轉(zhuǎn)動能量Er。 即即: EEe+Ev+Er，且，且evr1011* 轉(zhuǎn)動能級間的能量差r：0.0050.05eV(電子伏特)，如果用能量很低的遠紅外光照射分子，分子吸收遠紅外光躍遷產(chǎn)生遠紅外吸收光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜，波長范圍 50m1000m ） 。 振動能級的能量差v約

10、為：0.05eV，躍遷產(chǎn)生近、中紅外吸收光譜或分子振動光譜，波長范圍 0.8 m 50 m , ） 電子能級的能量差e較大，為120eV。電子躍遷產(chǎn)生紫外可見吸收光譜或分子的電子光譜，吸收光譜在紫外可見光區(qū)（200800nm） m 10 3 m m m 10 6 m m 10 9 nmnm = 10 12 pmpm126、吸收光譜具有連續(xù)譜的光波通過物質(zhì)樣品時，處于基態(tài)的樣品原子或分子將吸收特定波長的光而發(fā)生能級躍遷，于是在連續(xù)譜的背景上出現(xiàn)相應的暗線或暗帶，稱為吸收光譜。 電子能級間躍遷的同時，總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振電子能級間躍遷的同時，總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級

11、間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。 13 7 7、單色光和互補光、單色光和互補光 單色光：單波長的光單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成由具有相同能量的光子組成) 互補光：共同組成白光的兩種顏色的光。互補光：共同組成白光的兩種顏色的光。白光橙光青藍光青藍光紅光紅光青光青光黃光藍光紫光綠光綠光14白白 光光(太陽光太陽光)紅外光（無色）紅外光（無色）可見光（有色）可見光（有色）:肉眼能感覺到的光，波長肉眼能感覺到的光，波長400-780 nm。紅、橙、黃、。紅、橙、黃、綠、青、藍、紫光綠、青

12、、藍、紫光紫外光（無色）；近紫外區(qū)，波長紫外光（無色）；近紫外區(qū)，波長200 - 400 nm的光的光.遠紫外區(qū)，波長遠紫外區(qū)，波長10 - 200 nm的光的光8 8、復合光復合光 由各種單色光組成的光。如白光由各種單色光組成的光。如白光15 光的互補：藍光的互補：藍 黃黃9 9、物質(zhì)顏色的產(chǎn)生、物質(zhì)顏色的產(chǎn)生 （物質(zhì)分子對光的選擇性吸收）（物質(zhì)分子對光的選擇性吸收）例：高錳酸鉀可選擇性吸收綠光，因而白光中剩下互補光例：高錳酸鉀可選擇性吸收綠光，因而白光中剩下互補光紫色光，溶液呈紫色。紫色光，溶液呈紫色。16白色光通過無色溶液白色光通過無色溶液溶液呈無色透明溶液呈無色透明白色光通過無色溶液白

13、色光通過無色溶液溶液呈黑色溶液呈黑色不吸收不吸收全吸收全吸收白色光通過無色溶液白色光通過無色溶液溶液呈互補光色溶液呈互補光色部分吸收（有選擇性）部分吸收（有選擇性）1710、光的吸收定律 朗伯比爾定律 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系 Ab 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。 A c 二者的結(jié)合稱為朗伯比耳定律。18 Alg（I0/It)= b c 式中： A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度； b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位； c：溶液的摩爾濃度，單位molL

14、。 ：摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù)在數(shù)值上等于濃度為1 mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。 單位 Lmolcm A Alglg（I I0/ /I It)= )= b cb c 式中：與與的關(guān)系為：的關(guān)系為： = =/M /M （M M為摩爾質(zhì)量）為摩爾質(zhì)量） c c：溶液的濃度，單位溶液的濃度，單位g gL L ：質(zhì)量吸光系數(shù)：當于濃度為：質(zhì)量吸光系數(shù)：當于濃度為1 1 g/Lg/L、液層厚度為液層厚度為1 1cmcm時，溶液在某一波長下的吸光度。時，溶液在某一波長下的吸光度。單位單位L Lg gcmcm。 百分吸光系數(shù)：百分吸光系數(shù)： 濃度為濃度為1g/100ml1g/

15、100ml（1%1%）, ,液層厚度為液層厚度為1 1cmcm時，溶液在某一波長下的吸光度。時，溶液在某一波長下的吸光度。%11cmE19 透光率和吸光度的關(guān)系 透光率：描述入射光透過溶液的程度描述入射光透過溶液的程度: 透射光的強度It與入射光強度I0之比稱為透光率(transmittance). 用T表示 T = I t / I0 吸光度：透光率的負對數(shù)稱為吸光度，用符號A表示。 A lg T A愈大，溶液對光的吸收愈多。t0lglgII=T-=A20 物質(zhì)對光的吸收偏離朗伯物質(zhì)對光的吸收偏離朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當

16、溶液濃度較高時），標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯這種現(xiàn)象稱為對朗伯比耳定律的偏離。比耳定律的偏離。 引起偏離的因素（兩大類）：引起偏離的因素（兩大類）： 1 1、 物理性因素，即儀器的非理想引起的；物理性因素，即儀器的非理想引起的； 2 2、化學性因素。、化學性因素。21 物理性因素物理性因素 分光光度計只能獲取近乎單色的狹窄光帶。分光光度計只能獲取近乎單色的狹窄光帶。 因而，復合光可導致對朗伯因而，復合光可導致對朗伯比耳定律的正或負偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光都會比耳定律的正或負偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光

17、都會引起對朗伯引起對朗伯比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。應選擇比較好的單比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。應選擇比較好的單色器。色器。 化學性因素化學性因素 朗伯朗伯比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液( (c10-c10 c 10 2 2 mol/L mol/L 時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。故：朗伯收。故：朗伯比耳定律只適用于稀溶液比耳定律只適用于稀溶液 。2211

18、11、吸收光譜曲線、最大吸收波長、吸收光譜曲線、最大吸收波長 吸收曲線：將不同波長的單色光依次通過溶液，測量溶液的吸光度A，以波長為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，得吸收曲線。最大吸收波長 吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用max表示。 定性鑒別物質(zhì)的依據(jù)max 定量分析的依據(jù)不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比，這是進行定量分析的依據(jù)。右圖：四種濃度的KMnO4的吸收曲線。.23討論：討論： （1）同一種物質(zhì)，對不同波長光的吸光度不同。不同物質(zhì)的）同一種物質(zhì)，對不同波長光的吸光度不同。不同物質(zhì)的max有有時可能相同，但時可能相同，但max不一定相同。不一定相同。 （2）同

19、一種物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線形狀相似）同一種物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線形狀相似max不變。不變。 （）對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和（）對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和max則不同。則不同。24任務二、紫外可見分光光度法 一、知識點： 分光光度計的結(jié)構(gòu)構(gòu)成 分光光度計的光路原理 分光光度計的類型及特點 250.5750.575光源單色器樣品池檢測器顯示顯示光源單色器樣品室（吸收池）檢測器信號顯示器26氘燈氘燈鎢燈鎢燈樣樣品品池池檢測器檢測器入射狹縫入射狹縫出射狹縫出射狹縫聚焦裝置聚焦裝置透鏡透鏡透鏡透鏡271. 1. 光源光源 是儀器中提供入射光的裝置?？梢蕴峁┳贤饣蚩梢姽狻Ｊ莾x器中提

20、供入射光的裝置?？梢蕴峁┳贤饣蚩梢姽?。 具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。 常用光源有兩種：常用光源有兩種： （）可見光源（）可見光源400400800 nm800 nm（如（如叫碘鎢燈）：叫碘鎢燈）：28（）紫外光源工作氣體（氫氣、氘氣）在陰陽兩極間放電，發(fā)射出1 16060375 nm375 nm波長范圍的紫外連續(xù)光譜。 A A、氫燈：、氫燈：根據(jù)陰陽極電壓高低不同，又分為低壓氫燈和高壓氫燈。 B B、氘燈：、氘燈：現(xiàn)在多用氘燈，氘燈的輻射強度大于氫燈。氘燈的輻射強度大于氫燈。 島津島津UV2450型、型、 UV mini-

21、1240型紫外可見分光光度計均具有碘鎢燈和氘燈兩種型紫外可見分光光度計均具有碘鎢燈和氘燈兩種光源。可發(fā)射光的波長范圍為：光源。可發(fā)射光的波長范圍為： nm。29 2.2.單色器單色器 將光源發(fā)射的復合光分解成單色光，并可從中選出任意波長的單色光，這樣一個光學系統(tǒng)。將光源發(fā)射的復合光分解成單色光，并可從中選出任意波長的單色光，這樣一個光學系統(tǒng)。入射狹縫：光源的光由此進入單色器，調(diào)節(jié)狹縫寬度可以調(diào)節(jié)入射光的強度。入射狹縫：光源的光由此進入單色器，調(diào)節(jié)狹縫寬度可以調(diào)節(jié)入射光的強度。 準光裝置：使入射光成為平行光束（含透鏡、反射鏡）準光裝置：使入射光成為平行光束（含透鏡、反射鏡） 聚焦裝置：透鏡或凹面

22、反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫。聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫。 30出射狹縫：只讓所需單色光通過，進入樣品池。出射狹縫：只讓所需單色光通過，進入樣品池。色散元件（棱鏡色散元件（棱鏡/光柵）：將復合光分解成單色光，光柵）：將復合光分解成單色光， 單色器部件最關(guān)鍵的部件。單色器部件最關(guān)鍵的部件。 利用不同波長的光有不同利用不同波長的光有不同 的折射率而使復合光分開的光學元件。的折射率而使復合光分開的光學元件。 有石英棱鏡、玻璃棱鏡兩種：有石英棱鏡、玻璃棱鏡兩種：石英棱鏡可用于紫外光區(qū)光譜的分光石英棱鏡可用于紫外光區(qū)光譜的分光玻璃棱鏡只用于可見光區(qū)光譜的分光

23、玻璃棱鏡只用于可見光區(qū)光譜的分光31棱鏡光路圖棱鏡光路圖32光柵光路圖光柵光路圖 利用光的衍射和干涉原理使復合光色散。利用光的衍射和干涉原理使復合光色散。33 3. 3. 樣品室（吸收池）樣品室（吸收池） 分光光度計中用來盛放溶液的容器分光光度計中用來盛放溶液的容器 樣品室放置吸收池（樣品池、比色皿）和相應的池架附件。樣品室放置吸收池（樣品池、比色皿）和相應的池架附件。 吸收池主要有石英池和玻璃池兩種：吸收池主要有石英池和玻璃池兩種： 石英池：用于紫外區(qū)石英池：用于紫外區(qū) 玻璃池：用于可見區(qū)。玻璃池：用于可見區(qū)。比色皿的規(guī)格：用厚度（光束通過溶液的路徑長度）表示：比色皿的規(guī)格：用厚度（光束通過

24、溶液的路徑長度）表示： 1mm 1mm、2mm2mm、5mm5mm、1cm1cm、2cm2cm、4cm4cm。定量測定時，所使用的一組樣品池的規(guī)格要完全一致。定量測定時，所使用的一組樣品池的規(guī)格要完全一致。 344. 4. 檢測器：通過吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。檢測器：通過吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。（1 1）光電轉(zhuǎn)換器：）光電轉(zhuǎn)換器： 利用光電效應將透過吸收池的光信號轉(zhuǎn)化為可以測量的電信號的器件。利用光電效應將透過吸收池的光信號轉(zhuǎn)化為可以測量的電信號的器件。應用波段應用波段1901901100nm1100nm有：有：光電管（光電管（640

25、06400型火焰光度計的檢測器上使用）型火焰光度計的檢測器上使用） 光電倍增管（光電倍增管（ UV24 UV240 0型紫外可見分光光度計上用）型紫外可見分光光度計上用） 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器 光電晶體管（光電晶體管（ UVmini1240UVmini1240型紫外可見分光光度計上用型紫外可見分光光度計上用）在分光光度計中常用檢測器：光電管、光電倍增管。35光電管 光電管內(nèi)裝有一個陰極和絲狀陽極，兩極間加有高壓。 陰極的凹面涂一層對光敏感的堿金屬或堿金屬氧化物，當光線照射時，陰極金屬物質(zhì)由于光電效應而發(fā)射出自由電子，在陰陽兩極間高壓電場作用下加速射向陽極而形成電流。光越強，放出的電

26、子越多，電流就越強。電流通過光電管負載電阻，即可變成電壓信號，經(jīng)放大后將信號輸給信號顯示裝置。36光電倍增管光電倍增管 與光電管結(jié)構(gòu)上的差別： 在涂有光敏金屬的陰極和陽極之間還有9-169-16個個倍增光敏陰極。 當單色器分出的光照射到外加有負壓的光敏陰極K上，轟擊光敏材料，發(fā)射出一次光電子，一次光電子又射向第一倍增極（打拿極），轟擊出二次光電子，二次光電子又射向第二倍增極（打拿極），轟擊出更多的光電子，依次倍增，在最后放出的光電子，比最初增加106倍以上，這此電子最后射向陽極，形成電流。 最大電流可達 10A，電流經(jīng)負載電阻轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘査腿敕糯笃?，?jīng)放大后將信號輸入顯示裝置。 37二極管陣

27、列檢測器 微型紫外分光光度計常用二極管陣列檢測器，體積小。二極管陣列檢測器由集成在硅片上的幾百個至上千個光敏二極管、場效應管及移位寄存器所組成。385. 5. 結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)結(jié)果顯示記錄系統(tǒng) 檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理。檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理。39 721型可見分光光度計40721型可見分光光度計（模型）4142722型可見分光光度計4344日本島津Uvmini-1240型紫外-可見分光光度計45日本島津UV2450型紫外可見分光光度計波長范圍：190-900nm，雙光束方式 光電倍增管檢測器4647分光光度計的類型及特點分光光度計的類型及特點

28、根據(jù)儀器光學系統(tǒng)的不同，紫外分光光度計分為有兩類：單波長分光光度計雙波長分光光度計單光束分光光度計雙光束分光光度計481. 1. 單光束單光束分光光度計由一束經(jīng)過單色器的光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光強度測量。由一束經(jīng)過單色器的光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光強度測量。 特點是：結(jié)構(gòu)簡單特點是：結(jié)構(gòu)簡單 、價格便宜、價格便宜 ，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，主要適，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，主要適于做定量分析。于做定量分析。缺點是：測量結(jié)果受電源的波動影響較大，容易給定量結(jié)果帶來較大誤差，對光源缺點是：測量結(jié)果受電源的波動影響較大，容易給定量結(jié)果帶來較大誤

29、差，對光源和檢測器等電學組件的質(zhì)量要求很高具有的穩(wěn)定性。和檢測器等電學組件的質(zhì)量要求很高具有的穩(wěn)定性。 主要有國產(chǎn)的主要有國產(chǎn)的721721型、型、 751751型型 、島津島津UVmini-1240UVmini-1240型型49單波長單光束分光光度計結(jié)構(gòu)及原理示意圖0.575光源單色器樣品池檢測器顯示參比池50 2 2、雙光束紫外分光光度計、雙光束紫外分光光度計 光源發(fā)出的復合光，經(jīng)單色器色散為單色光，此單色光經(jīng)過切光器，將其分成光源發(fā)出的復合光，經(jīng)單色器色散為單色光，此單色光經(jīng)過切光器，將其分成S S、R R兩束光線，并分別通過樣品池和參比池，各自到達檢測器（光電倍增管），并把來自兩兩束光

30、線，并分別通過樣品池和參比池，各自到達檢測器（光電倍增管），并把來自兩光束的電信號加以比較，獲得吸光度的差值光束的電信號加以比較，獲得吸光度的差值A(chǔ)A，進行定量分析。，進行定量分析。雙光束分光光度計的特點：雙光束分光光度計的特點：因樣品溶液、空白溶液的對比測定幾乎同時進行，不會受到光源與檢測系統(tǒng)漂移產(chǎn)生的因樣品溶液、空白溶液的對比測定幾乎同時進行，不會受到光源與檢測系統(tǒng)漂移產(chǎn)生的影響，可消除背景干擾。但光路復雜、價格高。如日本島津影響，可消除背景干擾。但光路復雜、價格高。如日本島津UV2450UV2450型紫外可見分光光型紫外可見分光光度計度計51差值A(chǔ)光源單色器吸收池檢測器顯示切光器單波長雙

31、光束分光光度計結(jié)構(gòu)及原理圖參比池雙道雙道523 3、雙波長、雙波長分光光度計 光源輻射通過兩個單色器，分出兩束不同波長的光光源輻射通過兩個單色器，分出兩束不同波長的光( (1 1、2 2) ) ，經(jīng)切光器并束后于不，經(jīng)切光器并束后于不同時間、交替通過盛有同時間、交替通過盛有“空白空白+ +試樣試樣”溶液的吸收池（無需參比池），而后到達檢測器，溶液的吸收池（無需參比池），而后到達檢測器，經(jīng)儀器的電子學裝置直接獲得兩光束的吸光度之差經(jīng)儀器的電子學裝置直接獲得兩光束的吸光度之差AA進行定量分析。進行定量分析。53單色器.吸收池檢測器1122雙波長分光光度計結(jié)構(gòu)及原理圖雙波長分光光度計結(jié)構(gòu)及原理圖單色

32、器1切光器切光器54任務二、紫外可見分光光度法知識點：分析條件的選擇技能點：實訓一、吸收曲線的繪制（721型光光度計手動繪制、UV1240自動繪制）實訓二、吸光系數(shù)的測定（721型光光度計手動測定、UV1240自動測定）實訓三、物質(zhì)含量測定 鄰菲啰啉顯色可見分光光度法測定水中微量Fe含量 55知識點：分析條件的選擇一、顯色反應條件的選擇一、顯色反應條件的選擇二、儀器測定條件的選擇二、儀器測定條件的選擇三、參比溶液的選擇三、參比溶液的選擇一、顯色反應條件的選擇一、顯色反應條件的選擇1.顯色反應要求顯色反應要求 顯色劑選擇性好，顯色反應靈敏度高、生成物穩(wěn)定、顯色劑在測定波長處無明顯顯色劑選擇性好，

33、顯色反應靈敏度高、生成物穩(wěn)定、顯色劑在測定波長處無明顯吸收，顯色劑與產(chǎn)物的顏色差異明顯，要求兩種有色物之間最大吸收波長之差吸收，顯色劑與產(chǎn)物的顏色差異明顯，要求兩種有色物之間最大吸收波長之差“對對比度比度”： 60nm。56顯色劑顯色劑 無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。 有機顯色劑：種類繁多有機顯色劑：種類繁多（）（）三苯甲烷類三苯甲烷類：鉻天青鉻天青S S( (AlAl3 3+)+)、二甲酚橙、二甲酚橙( (FeFe3 3+ +、CuCu2 2+ +、BiBi3 3+ +、PbPb2 2+)+)等等（）偶氮類顯色劑（）偶氮類顯色劑：

34、本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應用最廣泛。穩(wěn)定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應用最廣泛。如偶氮胂如偶氮胂( (測測CaCa2 2+ +、PbPb2 2+)+)、鄰菲羅啉（、鄰菲羅啉（FeFe2 2+ +、CuCu2 2+ +）等等。 572.2.顯色劑濃度、用量顯色劑濃度、用量 吸光度吸光度A A與顯色劑用量與顯色劑用量CRCR的關(guān)系會出現(xiàn)的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。3.3.溶液的酸度

35、溶液的酸度 在相同實驗條件下，分別測定不同在相同實驗條件下，分別測定不同pHpH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的pHpH范圍。有色物本身是一種配合物。范圍。有色物本身是一種配合物。4.4.顯色時間與溫度顯色時間與溫度 實驗確定，一般實驗確定，一般min.min.有的在常溫有的要加熱，應保持標準系列有的在常溫有的要加熱，應保持標準系列與樣品測定一致與樣品測定一致5.5.溶劑：溶劑： 一般盡量采用有機溶劑測定一般盡量采用有機溶劑測定. .提高有色物質(zhì)的穩(wěn)定性提高有色物質(zhì)的穩(wěn)定性586 6、顯色反

36、應中的共存離子的干擾及消除、顯色反應中的共存離子的干擾及消除干擾：干擾： 生成有色物質(zhì)使結(jié)果偏高生成有色物質(zhì)使結(jié)果偏高 共存離子本身有色共存離子本身有色 消耗顯色劑，妨礙正常顯色消耗顯色劑，妨礙正常顯色消除方法：消除方法： （1 1）加入掩蔽劑）加入掩蔽劑 選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應產(chǎn)物不干擾待測組分的測定。產(chǎn)物不干擾待測組分的測定。 例如：用鉻天菁例如：用鉻天菁S S光度法測定光度法測定AlAl3+3+時，加入抗壞血酸作掩蔽劑將時，加入抗壞血酸作掩蔽劑將FeFe3

37、+3+還原為還原為FeFe2+2+，消除消除FeFe3+3+的干擾。的干擾。 （2 2）分離干擾離子（如萃取分離法）分離干擾離子（如萃取分離法） （3 3）選擇適當?shù)娘@色反應條件（如酸度）和測定條件（如入射波長參比溶液）。）選擇適當?shù)娘@色反應條件（如酸度）和測定條件（如入射波長參比溶液）。 59二、儀器測定條件的選擇二、儀器測定條件的選擇1.1.選擇適當?shù)娜肷洳ㄩL選擇適當?shù)娜肷洳ㄩL 一般應該選擇一般應該選擇maxmax為入射光波長。為入射光波長。 如果如果maxmax處有共存組分干擾時，則應考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波處有共存組分干擾時，則應考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波

38、長。長。60三、參比溶液選擇三、參比溶液選擇 通過適當組分的溶液作為調(diào)節(jié)儀器通過適當組分的溶液作為調(diào)節(jié)儀器 A A值（值（A=0A=0）或）或T(T(透光率透光率T=100%)T=100%)，以消除吸收池試劑等，以消除吸收池試劑等對入射光的吸收，使測得的吸光度真正反映待測溶液的吸光強度。對入射光的吸收，使測得的吸光度真正反映待測溶液的吸光強度。參比溶液類型及選擇原則：參比溶液類型及選擇原則： 溶劑參比：如只有待測組分與顯色劑的反應產(chǎn)物在測定波長處有吸收，可用溶劑作參比溶溶劑參比：如只有待測組分與顯色劑的反應產(chǎn)物在測定波長處有吸收，可用溶劑作參比溶液，以消除吸收池、試劑等因素的影響；液，以消除吸

39、收池、試劑等因素的影響； 試劑參比：若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處也略有吸收，則按顯色反應相同條件加試劑參比：若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處也略有吸收，則按顯色反應相同條件加試劑、顯色劑和溶劑，只是不加試樣，是又叫試劑、顯色劑和溶劑，只是不加試樣，是又叫“試劑空白試劑空白”( (不加試樣溶液不加試樣溶液) )參比溶液。參比溶液。61 試液（樣品）參比：若待測試液中干擾組分在測定波長處有吸收，但不與顯色劑起顯色試液（樣品）參比：若待測試液中干擾組分在測定波長處有吸收，但不與顯色劑起顯色反應，則可用反應，則可用“試樣空白試樣空白”( (不加顯色劑的樣品溶液不加顯色劑的樣品溶液) )作參比溶

40、液；其它應加的試劑應與加顯作參比溶液；其它應加的試劑應與加顯色劑的待測樣品溶液同樣進行。色劑的待測樣品溶液同樣進行。 褪色參比（平行操作參比）：若顯色劑、試液中其它組分在測量波長處有吸收，則可褪色參比（平行操作參比）：若顯色劑、試液中其它組分在測量波長處有吸收，則可讓顯色的試液加入適當褪色劑，將顯色的待測液褪色作為參比溶液。讓顯色的試液加入適當褪色劑，將顯色的待測液褪色作為參比溶液。62四四. .選擇適當?shù)拇郎y溶液濃度，以控制適宜的吸光度讀數(shù)范圍選擇適當?shù)拇郎y溶液濃度，以控制適宜的吸光度讀數(shù)范圍 不同的透光度讀數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同，濃度測量值的相對誤差（不同的透光度讀數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同，

41、濃度測量值的相對誤差（c c/ /c c）不僅與儀不僅與儀器的透光度誤差器的透光度誤差T T 有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)T T 的值也有關(guān)。的值也有關(guān)。 用儀器測定時應盡量使溶液透光度值在：用儀器測定時應盡量使溶液透光度值在： T T %=20%=2065% 65% 吸光度吸光度 A A =0.70=0.700.200.20。 63實訓一、吸收曲線的繪制（721型光光度計手動繪制、UV1240自動繪制） 一、721型分光光度計操作（1）在儀器尚未接通電源時，電表的指針必須位于“0”刻線上，若不在零點，則調(diào)節(jié)電表上零點校正螺絲，使指針至“0”。 （2）打開比色皿暗盒蓋已關(guān)閉

42、光門，打開電源開關(guān)，預熱儀器20min。（3）將波長調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至所需波長，將靈敏選擇預置于“1”檔。（4）用“0”透光率調(diào)節(jié)旋鈕將儀器調(diào)節(jié)在透光率“0”處，常稱此操作為調(diào)節(jié)機械零點。64（5）將裝有溶液的比色皿放入比色皿架中。蓋上比色皿暗盒蓋，此時光路開啟。讓參比溶液置于光路上，用“100%”透光率調(diào)節(jié)旋鈕使電表指針指在透光率100%位置（即A=0.00）（6）重復幾次打開、關(guān)上比色皿暗盒蓋，反復調(diào)整透光率“0”和“100%”,待指示穩(wěn)定后，方可開始測量。（7）將待測溶液推入光路，讀取吸光度。讀數(shù)后將比色皿暗盒蓋打開。（8）每當改變波長測量時，必須重新校正透光率“0”和“100%”。（9）儀器

43、使用完畢，取出比色皿，洗凈、晾干。關(guān)閉電源開關(guān)，拔下電源插頭，復原儀器。 65（二） 自動繪制吸收曲線 儀器：島津UV1240型紫外可見分光光度計 天津UV5501型紫外可見分光光度計 662、儀器：島津UV1240型紫外可見分光光度計 單元-顯示操作菜單和測量結(jié)果鍵盤：-輸入操作指令和數(shù)值67島津島津UVmini-1240型紫外型紫外可見分光光度計可見分光光度計儀器面板儀器面板68島津島津UVmini-1240UVmini-1240型型紫外可見分光光度計儀器鍵盤鍵盤：START/SFOP:參數(shù)設(shè)置好后,按下該健開始測定,或停止測定.AUTO ZERO:將波長下的讀數(shù)自動歸零GOTO WL:改

44、變當前波長設(shè)置ENTER:當輸入數(shù)值(如波長),或顯示模式,必須按下該健確認.光標():可選一個項目,左右移動液晶屏上的光標,左光標還用于輸入負數(shù).功能鍵:與液晶屏顯示的功能相對應RETURN:可以從當前屏幕反回前一屏幕LCD CONT:按該健同時按住光標健,可改變液晶屏幕顯示的對比度.PRINT:輸出到打印機數(shù)字鍵:輸入數(shù)值CE鍵:用該健清除數(shù)值輸入的錯誤,重新輸入數(shù)值69一、預備操作1、開機前確認樣品室里沒有樣品或其他東西檔住光路。2、關(guān)好樣品室，打開電源開關(guān)，儀器開始初始化，直至初始化畫面上每一項都顯示“OK”。3、儀器初始化完成并預熱10分鐘后，根據(jù)自己的檢測需要按數(shù)字鍵選擇相對應的測

45、量模式。 光度模式：單點法測含量時選用 光譜模式：測吸收曲線（最大吸收波長）時選用 定量模式：多點法測含量時選用70二、系統(tǒng)設(shè)置操作 按數(shù)字鍵“5”進入系統(tǒng)設(shè)置模式，在“系統(tǒng)設(shè)置”模式下： 按數(shù)字鍵“1”進入啟動程序設(shè)置 按數(shù)字鍵“2” 進入顯示數(shù)據(jù)設(shè)置 按“3”進入光源設(shè)置，波長200400nm設(shè)氘燈，波長400800nm設(shè)鎢燈，按“ENTER”鍵確認。， 按“5”進入時鐘設(shè)置 按“6”進入蜂鳴設(shè)置71三、測定操作（一）繪吸收曲線、測最大吸收波長 -光譜測定模式 按“返回鍵”，在初始化畫面上按按數(shù)字鍵“2”進入光譜測定模式。 在光譜測定模式下，按“1”，設(shè)定測定方式：有吸光度ABS/透光率T

46、/energy三種，選吸光度ABS，按 “ENTER”鍵確認。 在光譜測定模式下，按“2”設(shè)定波長范圍。200-400 將空白樣品置于樣品室并關(guān)緊樣品室，按“F1”儀器進行自動基線校正。72 聽到蜂鳴聲表示已經(jīng)校正基線，將空白溶液換成樣品，關(guān)緊樣品室，按“START/STOP”鍵，儀器開始自動掃描，測量樣品在不同波長下的吸光度，屏幕上顯示以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標的吸收光譜曲線。 聽到蜂鳴聲表示掃描完畢，按“F2”即得到峰表，顯示峰檢測，橫坐標下即為最大吸收波長。（ Vc的最大吸收波長245nm）73 （二）單點法測物質(zhì)含量 吸光度模式、對照品比較法測定物質(zhì)含量 按“返回鍵”，在初始化畫

47、面上按數(shù)字鍵“1”進入光度測定模式 按“GOTO WL”設(shè)定波長（被測物質(zhì)的最大吸收波長）并按“ENTER”鍵確認。 按相應的功能鍵“F1F4”輸入需要測定的參數(shù)。 將裝有空白樣品的比色皿放入樣品室，并關(guān)好樣品室。 按“AUTO ZERO”鍵進行自動調(diào)零。 將空白樣品拿出倒掉，分別裝入標樣/樣品，并關(guān)緊樣品室（仍是同一比色皿）。 按功能鍵F1切換測定物質(zhì)的吸光度ABS，按“START/STOP”鍵，分別進行標樣/樣品測試，或按功能鍵F3后再按“START/STOP”鍵進入測試，得出待測吸光度A。 樣品濃度的計算：CX=（AX/AS）CS （ %或g/ml）74對照品比較法特點： 能消除儀器誤差

48、，但需要對照品，美國藥典多用此法，中國藥典應用不多，主要有：水楊酸鎂、阿莫西林、氨芐西林鈉、貝諾酯。對照品比較法實例： 精密稱取貝諾酯藥品0.0750g，用無水乙醇定容到50ml，再定量稀釋200倍后，在240nm波長處測定其吸光度（設(shè)為0.5585）。另取105干燥2hr的貝諾酯對照品0.0400g用無水乙醇定容到50ml，配成8.0g/ml的對照品溶液(100倍)，同樣測定其吸光度（設(shè)為0.5960），計算貝諾酯藥品中貝諾酯的百分含量。結(jié)果計算式：）（C）（AACRRXX對照品溶液濃度對照品吸光度供試溶液吸光度供試品溶液濃度)(%100(100750.05020085960.0)(5585

49、.0)(%6）gmlArAX樣品重量倍對照品溶液吸光度供試溶液吸光度貝諾酯75（二）單點法測物質(zhì)含量 吸光度模式、吸收系數(shù)法測定物質(zhì)含量 按“返回鍵”，在初始化畫面上按數(shù)字鍵“1”進入 光度測定模式 按“GOTO WL”設(shè)定波長（被測物質(zhì)的最大吸收波長） 并按“ENTER”鍵確認。 按相應的功能鍵“F1F4”輸入需要測定的參數(shù)。 將裝有空白樣品的比色皿放入樣品室，并關(guān)好樣品室。 按“AUTO ZERO”鍵進行自動調(diào)零。 將空白樣品拿出倒掉，裝入樣品，并關(guān)緊樣品室 （仍是同一比色皿）。 按功能鍵F1切換測定物質(zhì)的吸光度ABS，按“START/STOP”鍵進行待測溶液測試，或按功能鍵F3后再按“S

50、TART/STOP”鍵進入待測溶液測試，得出待測溶液的吸光度A。76吸收系數(shù)法原理A=ECL C=A/EL%1100/(%11cmEAml）gC測試液濃度%100%1%11）W（EAcm樣品重量供試液總體積稀釋倍數(shù)供試品含量可從中國藥典查到%11cmE值厚時的液層溶液濃度為Ecm、mlg（Ecm1)100/1%1,%11,:100/1:%11CAmlgEcm77吸收系數(shù)法特點： 不需要對照品 ，英國藥典多用此法，但儀器誤差大（如波長、吸收池誤差），中國藥典多用此法實例： 精密稱取VB12藥片0.0075g，用水溶解，定容到50ml，再定量稀釋5倍后，在361nm波長處測定其吸光度（設(shè)為 0.5

51、80）。查中國藥典知本品的吸光度為 計算其百分含量。結(jié)果計算式：207%11為cmE%100%1%11）W（EAcm樣品重量供試液總體積稀釋倍數(shù)供試品含量%100%)51(0075.0505%1207580.012含量維生素B78%1100/(%11cmEAml）gC測試液濃度可從中國藥典查到%11cmE%100%1%11）W（EAcm樣品重量供試液總體積稀釋倍數(shù)供試品含量值厚時的液層溶液濃度為Ecm、mlg（Ecm1)100/1%1,%11,:100/1:%11CAmlgEcm待測溶液濃度的計算：吸收系數(shù)法A=ECL C=A/EL20712%11為的如cmEVB79（三）多點法測物質(zhì)含量（標

52、準曲線法） 先配制一系列濃度少不同的標準溶液（成梯度），在同一條件下分別測定其A值，然后繪制其AC圖（工作曲線）。再在同樣條件下測定樣品的A值，從AC工作曲線上查出樣品的C值，最后計算出樣品的含量。 特點： 不需知道 ， 對儀器要求不高 ，但操作麻煩，需要標準品。%11cmE801、定量設(shè)定 按“返回鍵”，在初始化畫面上-模式選擇屏幕中選擇， 顯示儀器處于定量模式。 在定量模式下按1進入，再選“1”單波長，再輸入最大吸收波長, 按“ENTER”鍵確認。 在定量模式下按“2”進入定量方法設(shè)定，再按“3”設(shè)定多點校準， 再設(shè)定多點校準下的標準個數(shù)為“4”（一個空白樣品，三個標樣）， 按“ENTER

53、”鍵確認。 在定量模式下按3進入設(shè)定，輸入1測定一次。按“ENTER”鍵 確認，過原點：“是”，按“ENTER”鍵確認。 在定量模式下按4進入設(shè)定，要與樣品實際單位一致。 在定量模式，屏幕下方出現(xiàn)“取得ABS值的方法？”這時按數(shù)字鍵2，選2812、測定 定量方法設(shè)定后，按“START/STOP”鍵，屏幕上面出現(xiàn)出現(xiàn)標樣表。 進入標樣的濃度的輸入，要求輸入標樣濃度值，依次輸入一個空白溶液濃度（0.00）和三個標樣的濃度值（ 8.0g/ml 、16 g/ml、24 g/ml ），都按“ENTER”鍵確認 依次放入四個樣品（一個空白和三個標樣），每次按“START/STOP”鍵，依次測量出四個樣品（

54、1空白、3標樣）的吸光度。 換成待測樣品放入比色池，再按“START/STOP”鍵，顯示待測樣品的吸光度和濃度?；蛘甙础癋3”樣品測定，再按“START/STOP”鍵同樣進入待測樣品的測定。82天津天津UV5501型紫外可見分光光度計型紫外可見分光光度計SETstartESC/STOPENTERF1F2F3F40Abs/100%TSave83天津UV5501型紫外可見分光光度計操作方法 打開電源，儀器進行自檢，等15分鐘后進入主菜單一、吸收曲線（波長掃描） 1、在主菜單下選擇1 進入光度計模式，將空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T進行本底測量，顯示校準（Blanking） 2、按SE

55、T設(shè)置波長，從鍵盤輸入波長，按回車盤（ENTER）確認設(shè)置，自動進行本底測量，顯示：0.000 Abs 3、在主菜單下按3選擇“光譜掃描”。 4、按F1（掃描設(shè)置）設(shè)定起始波長、終止波長，掃描間隔設(shè)為0.5nm，拋描速度設(shè)“高速”。84 5、按F2（模式）選擇測量模式，選“吸光度”模式 6、將空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T掃描基線。按ESC/STOP停止掃描。 7、將裝有樣品的比色皿推入光路中，按START開始掃描樣品，得到吸收曲線，按ESC/STOP停止掃描 8、按F3（檢索），配合、，逐點查吸收曲線上各點上的Abs值與波長值，配合、逐峰查吸收曲線上各峰上的Abs值與波長值。結(jié)

56、果將顯示在屏幕右上角。85二、樣品測定（一）樣品吸光度測定：1、將空白比色皿推入光路中，在主菜單下選擇1 進入“光度計模式” ，自動進行本底測量，顯示：0.000 Abs，等待操作下一步2、按F2（模式）選擇測量模式，選“吸光度”模式，按0Abs/100%T 進行校準（Blanking）3、將樣品比色皿推入光路中，讀取數(shù)據(jù)Abs值。86（二）對照品比較法測定物質(zhì)含量1、按F1（設(shè)置單位）mg/l（用方向鍵選擇單位或自定義單位如g/l）。2、將空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T 進行本底測量3、將裝有標樣的比色皿推入光路中，按F4（標樣測定），輸入標樣己知濃度值C，將裝有樣品的比色皿推

57、入光路中，讀取樣品濃度值。87（三）標準曲線法測定樣品 1、在主菜單下按F2，選擇“定量測試”，按F1（單位），選擇濃度單位 2、按SET設(shè)置波長、校正方法為標準曲線（單點/標準曲線/3點），按兩次ESC/STOP，選F2（擬合曲線），按F1選擬合方法為“線性擬合/線性過0點”，按F3（標樣設(shè)定），通過測定一組標準樣品的測定建立工作曲線（即輸入樣品的標準濃度，每次輸入后按ENTER），按ESC/STOP退出。 3、將空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T ，進行校準（Blanking）884、將一組將有標準樣品的比色皿逐個推入光路，每次按START，按F4畫出曲線，按SAVE保存曲線，按

58、ESC/STOP退出。5、將空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T進行本底測量，將樣品比色皿推入光路中，每次按START，結(jié)果將顯示在屏幕上。6、按SAVE保存結(jié)果和擬合參數(shù)。 ID Abs Conc.(mg/l)或g/l 1 0.062 0.076 2 0.065 0.07889 實訓三 鄰菲啰啉分光光度法測定水中微量Fe的含量 1、試劑：標準硫酸亞鐵、鐵銨礬（硫酸亞鐵銨）、鄰二氮菲（1.5g/L）、鹽酸羥胺（100g/L ）、HAC-NaAC緩沖溶液 2、原理 鄰二氮菲是鐵的顯色劑，在PH為29時與亞鐵離子生成橙紅色配合物，但與Fe3+生成 的配合物為藍色，所以，事先要加鹽酸羥胺還原

59、劑將Fe3+還原成亞鐵離子。由于亞鐵離子易水解，所在要加HAC-NaAC緩沖溶液，穩(wěn)定PH在56，防止亞鐵離子水解，使顯色完全。 取系列濃度標準溶液，測定吸光度A，作吸光度A對溶液濃度c的圖，得過坐標原點的直線。 在相同條件下，測量被測溶液的吸光度。 在標準曲線上查得溶液濃度。90 3、工作曲線的繪制 （1）配鐵標準溶液： 稱取0.4317g硫酸亞鐵標樣加6ml/L HCl 20ml，用蒸餾水定容到500ml(濃度100ug/ml) （2）配Fe 標準系列： 取鐵標準溶液25ml稀到500ml，濃度5 ug/ml(標樣2) 分別取標樣2 0.00ml 5.00ml 10.00ml 20.00ml到50ml容量瓶中， 分別加鄰二氮菲5ml、鹽酸羥胺1ml、HAC-NaAC緩沖溶液5ml，定容到50ml。 標準系列： 0.00ug/ml、 0.50、 1.00、 2.00ug/ml91標準曲線 C92 4、最大吸收波長測定（440580nm每隔10nm測一次A值，作吸收曲線，確定最大吸收波長max 5、樣品測定操作 （1） 取自來水30.00ml,分別加鄰二氮菲5ml、鹽酸羥胺1ml、HAC-NaAC緩沖溶液5ml，定容到50ml。 （2）在儀器尚未接通電源時，電表的指針必須位于