常用分子生物學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用

1、常用分子生物學(xué)技常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用術(shù)的原理及應(yīng)用The Popular Technology in Molecular Biology: The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and ApplicationPrinciple and Application生物化學(xué)教研室 整理課件分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Molecular Hybridization & Blotting TechnologyBlotting Technology第第 一一 節(jié)節(jié)整理

2、課件整理課件例：例：變性引起紫外吸收值的改變變性引起紫外吸收值的改變DNADNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：增色效應(yīng)：DNADNA變性時(shí)其溶液變性時(shí)其溶液A A260260增高的現(xiàn)象。增高的現(xiàn)象。整理課件熱變性熱變性解鏈曲線：解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱如果在連續(xù)加熱DNADNA的過(guò)程中以溫度的過(guò)程中以溫度對(duì)對(duì)A A260260（absorbanceabsorbance，A A，A A260260代表溶液在代表溶液在260nm260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。整理課件 Tm：( m e l t i n g temperatur

3、e) 變性是在一個(gè)變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最光吸收值達(dá)到最大值的大值的50%50%時(shí)的時(shí)的溫度稱為溫度稱為DNADNA的的解鏈溫度，又稱解鏈溫度，又稱融解溫度融解溫度。其大小與其大小與G+CG+C含量成正比。含量成正比。整理課件整理課件（一）核酸分子雜交（一）核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) (nucleic acid hybridization ) 在在DNADNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNADNA單鏈分子放在同一溶液中，或把單鏈分子放在同一溶液中

4、，或把DNADNA與與RNARNA放在一起，只要在放在一起，只要在DNADNA或或RNARNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈化雙鏈(heteroduplex)(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理整理課件DNA-DNADNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復(fù)性復(fù)性 不同來(lái)源的不同來(lái)源的DNADNA分子分子核酸分子雜交核酸分子雜交 (hybridization)(hybridization) 整理課件復(fù)性復(fù)性RNADNA整理課件整理課

5、件核酸分子雜交的應(yīng)用核酸分子雜交的應(yīng)用研究研究DNADNA分子中某一種基因的位置分子中某一種基因的位置鑒定兩種核酸分子間的序列相似性鑒定兩種核酸分子間的序列相似性檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ) 整理課件（二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù) 探針探針 (probe) (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在列的多聚核苷酸，與固定在NCNC膜上膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸

6、分子存在。核酸分子存在。 整理課件放射性：放射性： 3232P P、3535S S和和3 3H H 非放射性：非放射性：生物素、地高辛素、生物素、地高辛素、 熒光素?zé)晒馑?( (整理課件二、印跡技術(shù)二、印跡技術(shù)（印跡雜交）（印跡雜交） 將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固定化介質(zhì)上并（印跡）或直接放在固定化介質(zhì)上并 加以檢測(cè)分析的技術(shù)。加以檢測(cè)分析的技術(shù)。廣泛應(yīng)用于廣泛應(yīng)用于DNADNA、RNARNA、 蛋白質(zhì)檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)、真空吸引轉(zhuǎn)移印跡電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)、真空吸引轉(zhuǎn)移印跡整理課件印跡技術(shù)的分類及應(yīng)用印跡技術(shù)的分類及應(yīng)用（一）（一）DN

7、ADNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Southern blotting) (Southern blotting) 用于基因組用于基因組DNADNA、重組質(zhì)粒、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。和噬菌體的分析。（二）（二）RNARNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Northern blotting)(Northern blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。整理課件 其他其他斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)(in situ hybridization)DNADNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (DNA

8、array)(DNA array) DNADNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)(DNA chip)（三）蛋白質(zhì)的印跡分析（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Western blotting)(Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性、定量及相互作用用于蛋白質(zhì)定性、定量及相互作用 研究。研究。整理課件 用于基因組用于基因組DNADNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。整理課件DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記與放射性標(biāo)記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片片段

9、的凝膠段的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液用緩沖液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜整理課件DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody , Wash to remove

10、unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography整理課件分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn) 整理課件整理課件 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 1 1 細(xì)胞裂解物的準(zhǔn)備；細(xì)胞裂解物的準(zhǔn)備； 2 2 細(xì)胞裂解物的蛋白定量；細(xì)胞裂解物的蛋白定量； 3 3 細(xì)胞裂解物的細(xì)胞裂解物的SDS-PAGESDS-PAGE； 4 4 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移；蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移； 6 6 目的蛋白質(zhì)的檢測(cè)。目的蛋白質(zhì)的檢測(cè)。整理課件整理課件 免疫印跡只能檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)含量免疫印跡只能檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)含量 測(cè)定相對(duì)含量時(shí)，需要內(nèi)參照測(cè)定相對(duì)含量時(shí)，需要內(nèi)

11、參照 選擇合適的反應(yīng)條件：選擇合適的反應(yīng)條件：SDS-PAGESDS-PAGE膠濃度；膠濃度；轉(zhuǎn)移膜的選擇；轉(zhuǎn)移時(shí)間的選擇轉(zhuǎn)移膜的選擇；轉(zhuǎn)移時(shí)間的選擇 注意電極的正負(fù)極注意電極的正負(fù)極 抗體反應(yīng)時(shí)，注意驅(qū)除反應(yīng)袋內(nèi)氣泡抗體反應(yīng)時(shí)，注意驅(qū)除反應(yīng)袋內(nèi)氣泡 操作要輕柔。操作要輕柔。整理課件三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較12月24日上午9：00整理課件分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)放放射射自自顯顯影影照照片片DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣1、印跡技術(shù)的分類、印跡技術(shù)的分類整理課件第二節(jié)第二節(jié)整理課件PCR是體外模擬天然是體外模擬天然DNADNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。 PCR類似于類似于DNA

12、DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程，可以將微量目的基因擴(kuò)增制過(guò)程，可以將微量目的基因擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上。一百萬(wàn)倍以上。整理課件 整理課件原理原理 類似于類似于DNADNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNADNA模板加熱模板加熱變性變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生序列發(fā)生退火退火，再將溫度升高使退火引物在，再將溫度升高使退火引物在DNADNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。 這種這種熱變性熱變性- -復(fù)性復(fù)性- -延伸延伸的過(guò)程就是一個(gè)的過(guò)程就是一個(gè)PCRPCR循環(huán)，

13、循環(huán)，PCRPCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。不斷重復(fù)。整理課件一、一、PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系MgMg2+2+ 模板模板DNADNA特異性引物特異性引物耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合酶dNTPsdNTPs整理課件n1 1、DNADNA聚合酶聚合酶nTaq DNATaq DNA聚合酶：聚合酶： 水生棲熱菌水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)(thermus aquaticus,Taq)的的DNADNA聚合酶聚合酶 作用：作用： 553DNA3DNA聚合酶活性；聚合酶活性； 無(wú)無(wú)3355外切酶活性外切酶活性，3535輪輪0.25%0.

14、25%錯(cuò)配錯(cuò)配，與原始模板有差別；與原始模板有差別； 整理課件最適溫度：最適溫度： 7272，選擇，選擇7272延伸延伸半衰期：半衰期：92.5 130min 92.5 130min 95 40min 95 40min 97.5 5 97.5 56min6min 延伸溫度（延伸溫度（7272） 9595使其在使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性整理課件作用：作用：5 53 3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：耐熱、耐熱、精確度精確度 pfu Taqpfu Taq不足：不足：但但pfupfu擴(kuò)增效率通常比擴(kuò)增效率通常比TaqTaq酶

15、略差酶略差 文獻(xiàn)報(bào)道：文獻(xiàn)報(bào)道：Taq+pfu Taq+pfu 會(huì)起到較好效果會(huì)起到較好效果 整理課件n 2.2.引物引物n 人工合成短寡核苷酸人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-6020bp-25bpTm=55-60，nTmTm值要相近，每條值要相近，每條10-50pmol /10010-50pmol /100 l l n 設(shè)計(jì)原則：設(shè)計(jì)原則： （1 1）靠近靠近55上游上游PrimerPrimer與雙鏈與雙鏈DNADNA正鏈相同正鏈相同 （2）Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列形成本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列形成 loop環(huán)，內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán)，內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu) （3）注意減少注意減少

16、Primer間互補(bǔ)序列間互補(bǔ)序列 導(dǎo)致導(dǎo)致2個(gè)個(gè)Primer形成形成dimer 一般不要超過(guò)一般不要超過(guò)3個(gè)互補(bǔ)個(gè)互補(bǔ)bp （4）Primer 5未端可修飾、突變未端可修飾、突變 （5）primer 5端增加堿基端增加堿基整理課件 3.3.模板：模板： 可選：可選：DNADNA mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA DNA DNA包括：包括： 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體 染色體染色體DNADNA 模板用量模板用量 Plasmid:lngPlasmid:lng Chromosome:300-500ng Chromosome:300-500ng 注意：注意： 防止交叉污染防止交叉污染整理課件：

17、四種脫氧核苷酸：基本原料四種脫氧核苷酸：基本原料終濃度：終濃度：5050 M M 注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效整理課件 2+2+ TaqDNA TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要聚合酶作用時(shí)需要MgMg2+2+ 不同的酶需不同不同的酶需不同MgMg2+2+ 外界影響：外界影響： EDTAEDTA鰲合鰲合MgMg2+ 2+ 選較低濃度選較低濃度TE(10mM TE(10mM Tris,1mMEDTA)Tris,1mMEDTA)； DNADNA模板、引物和模板、引物和dNTP dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與的磷酸基團(tuán)均可與MgMg2+2+ 結(jié)合，結(jié)合， 降低降低MgMg2+2

18、+有效濃度。有效濃度。 如果擴(kuò)增如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的MgMg2+2+濃度濃度整理課件 （1 1）變性溫度：）變性溫度：94-9594-95 GCGC比例高、長(zhǎng)度很長(zhǎng)，比例高、長(zhǎng)度很長(zhǎng)， TT （2 2）退火：）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于取決于TmTm值：值：TmTm退火退火TT；TmTm退火退火TT若若TmTm較高，可使退火和延伸在同一溫度較高，可使退火和延伸在同一溫度（3 3）延伸：）延伸： 500nt-1min 500nt-1min 500nt500nt3min3min一般：一般：404060sec6

19、0sec6.6.溫度溫度整理課件二、二、PCRPCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理變性變性95C延伸延伸72C72C退火退火TmTm5C5C整理課件5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 基本工作原理基本工作原理整理課件Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。整理課件（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（二）基因的體外突變（三）（三

20、）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNADNA序列測(cè)定序列測(cè)定（五）基因突變分析（五）基因突變分析三、三、PCRPCR技術(shù)的主要用途技術(shù)的主要用途整理課件（一）反轉(zhuǎn)錄（一）反轉(zhuǎn)錄PCRPCR技術(shù)技術(shù)（二）原位（二）原位PCRPCR技術(shù)技術(shù)（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCRPCR技術(shù)技術(shù)整理課件整理課件 利用實(shí)時(shí)熒光定量利用實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR的原理，對(duì)的原理，對(duì)DNADNA靶分子的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量的核酸檢測(cè)系靶分子的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量的核酸檢測(cè)系統(tǒng)。該方法精確、靈敏、污染途徑小。是國(guó)統(tǒng)。該方法精確、靈敏、污染途徑小。是國(guó)際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。際公認(rèn)的核酸分子

21、定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。 它是在它是在PCRPCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCRPCR過(guò)程，最后過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。法。 它已逐漸代替了它已逐漸代替了Norther blot Norther blot 以及以及semiRT-PCRsemiRT-PCR技術(shù)。技術(shù)。Real-time PCR整理課件實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理整理課件本節(jié)要點(diǎn)1、PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理整理課件核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 (Ma

22、xam-Gillbert(Maxam-Gillbert法法) )DNADNA鏈的末端合成終止法鏈的末端合成終止法 (sanger(sanger法法) )整理課件 設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的成套設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的成套DNADNA片片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測(cè)的使待測(cè)的DNADNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過(guò)裂或終止。通過(guò)PAGEPAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的核苷酸的DNADNA片段分開(kāi)，放射自顯影后，根據(jù)片段分開(kāi)，放射自顯影后，根據(jù)長(zhǎng)短排列，根據(jù)特定末端堿基的長(zhǎng)

23、短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNADNA片段就可片段就可讀出待測(cè)讀出待測(cè)DNADNA的堿基序列。的堿基序列。 酶法酶法 化學(xué)法化學(xué)法 測(cè)序技術(shù)進(jìn)展測(cè)序技術(shù)進(jìn)展整理課件 酶酶反反應(yīng)應(yīng)電電泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT3 5 GG5 3 引物引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGT

24、TGCTACC3 5 TCAACGATGG5 3 讀出模板讀出模板互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列讀出模板讀出模板序列序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGC整理課件 讀出模板互讀出模板互補(bǔ)序列補(bǔ)序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測(cè)讀出待測(cè)序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性標(biāo)記的引物放射性標(biāo)記的引物TGTTA C T Gd

25、dGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 整理課件computer analysis凝膠中凝膠中DNA移動(dòng)方向移動(dòng)方向樣品槽樣品槽激光器激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡成象透鏡聚焦透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)高靈敏度相機(jī)旋光鏡旋光鏡/棱鏡組件棱鏡組件整理課件 反應(yīng)試劑反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼反應(yīng)：肼C反應(yīng)：反應(yīng)：NaCl+肼肼整理課件一、化學(xué)裂解法一、化學(xué)裂解法( (Maxam-Gillbert法法) )基本原理基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使基于某些化學(xué)試劑可以使DNADNA鏈在鏈在1

26、1個(gè)或個(gè)或2 2個(gè)個(gè)堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的的DNADNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記分析前，用同位素標(biāo)記DNADNA的的5 5 末端，經(jīng)放末端，經(jīng)放射自顯影即可在射自顯影即可在X X膠片上讀出膠片上讀出DNADNA鏈的序列。鏈的序列。整理課件二、二、DNADNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法愛(ài)咪出版社公司內(nèi)部檔案數(shù)據(jù)

27、目錄 整理課件愛(ài)咪出版社公司內(nèi)部檔案數(shù)據(jù)目錄 整理課件整理課件三、三、DNADNA自動(dòng)測(cè)序自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)DNADNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行進(jìn)行SangerSanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNADNA片段上片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光

28、信號(hào)，并依此確定光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNADNA堿基的排列順序堿基的排列順序。 整理課件DNADNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例第四節(jié)第四節(jié)整理課件基因組基因組DNADNA文庫(kù)文庫(kù) (genomic DNA library)cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù) (cDNA library) 基因文庫(kù)基因文庫(kù) (gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列的克隆群體。序列的克隆群體。整理課件基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)整理課件第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例整理課件c

29、DNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫(kù)文庫(kù)整理課件 第五節(jié)第五節(jié) 生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technology整理課件是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段或片段或cDNAcDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上于單位面積的支持物上

30、 ，然后與待測(cè)的，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用激光熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針位點(diǎn)的熒光通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。得出定性和定量的結(jié)果。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip)整理課件目目 錄錄基因芯片技術(shù)原理基因芯片技術(shù)原理整理課件 是將高度密集排列的蛋白分子作是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可

31、捕獲樣品與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片整理課件第六節(jié)第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study整理課件一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量轉(zhuǎn)

32、換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選噬菌體顯示系統(tǒng)篩選n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)整理課件標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。 整理課件標(biāo)簽融標(biāo)

33、簽融合蛋白合蛋白沉淀實(shí)沉淀實(shí)驗(yàn)流程驗(yàn)流程示意圖示意圖整理課件（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途和用途整理課件n酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。用的生物信息學(xué)推測(cè)。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BDBD基因融合基因融合成為成為“誘餌誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD

34、AD基因融基因融合的合的“獵物獵物”基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)?；プ饔玫鞍踪|(zhì)。整理課件電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoretic (electrophoretic mobility shift assaymobility shift assay，EMSA)EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)(gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNADNA結(jié)合蛋結(jié)合蛋白與相應(yīng)白與相應(yīng)DNADNA序列間的相互作用，可用于定性和定序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因

35、子研究的經(jīng)典方法。目量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究前這一技術(shù)也被用于研究RNARNA結(jié)合蛋白和特定結(jié)合蛋白和特定RNARNA序列間的相互作用。序列間的相互作用。二、二、DNA-DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定整理課件放放射射自自顯顯影影未結(jié)合探針未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針未標(biāo)記探針10Xn凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖整理課件染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chroma

36、tin (chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)immunoprecipitation assay, ChIP)是是目前可以研究體內(nèi)目前可以研究體內(nèi)DNADNA與蛋白質(zhì)相互作用與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法（二）染色質(zhì)免疫沉淀法整理課件n染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖整理課件遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用The Establishment and Application of The Establishment and Application of He

37、redity-Modified Animal Model Heredity-Modified Animal Model 第七節(jié)第七節(jié)整理課件n轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受體動(dòng)物目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)整理課件整理課件n核轉(zhuǎn)移技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù)

38、即即動(dòng)物整體克隆技術(shù)動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物將動(dòng)物的一個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的一個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使的去胞核的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆之發(fā)育成個(gè)體，即克隆(clone)(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)整理課件n基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)(gene knock out) (gene knock out) 也稱也稱基因靶向基因靶向(gene targeting)(gene targeting)滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù)整理課件將滅活的基因放入胚胎干

39、細(xì)胞將滅活的基因放入胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell(embryonic stem cell，ES)ES)中，使這一滅中，使這一滅活基因通過(guò)同源重組取代原有的目的基因，活基因通過(guò)同源重組取代原有的目的基因，篩選到基因已定點(diǎn)滅活的細(xì)胞后，通過(guò)顯篩選到基因已定點(diǎn)滅活的細(xì)胞后，通過(guò)顯微注射將細(xì)胞注入小鼠囊胚中。細(xì)胞在小微注射將細(xì)胞注入小鼠囊胚中。細(xì)胞在小鼠囊胚中參與胚胎的發(fā)育，最終形成嵌合鼠囊胚中參與胚胎的發(fā)育，最終形成嵌合體小鼠。體小鼠。 n操作方式操作方式整理課件n建立動(dòng)物模型建立動(dòng)物模型 單基因決定疾病模型單基因決定疾病模型 基因剔除基因剔除獲得性突變獲得性突變(gain-o

40、f-function (gain-of-function mutation)mutation) 多基因決定疾病模型多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用發(fā)展中的作用第第 八八 節(jié)節(jié)整理課件克隆疾病相關(guān)基因的策略克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克?。ㄒ唬┕δ苄钥寺?functional cloning)(functional cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)(positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略(position-(position- i

41、ndependent candidate gene independent candidate gene approaches)approaches)（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略(positional (positional candidate gene approaches ) candidate gene approaches )整理課件定義定義 從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因?？寺≡撝虏』颉＃ㄒ唬┕δ苄钥寺。ㄒ唬┕δ苄钥寺?yīng)用應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺

42、傳性疾病。得到部分純化的遺傳性疾病。整理課件克隆方式克隆方式 利用特異性抗體篩選表達(dá)型利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNAcDNA文庫(kù)；文庫(kù)； 根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選酸作探針，篩選cDNAcDNA文庫(kù)。文庫(kù)。 功能互補(bǔ)試驗(yàn)功能互補(bǔ)試驗(yàn) (functional complementation assay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。 整理課件（二）定位克隆（二）定位克隆定義定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。小范圍，最后克隆該基因

43、。系統(tǒng)的定位克隆工作系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析遺傳學(xué)分析( (確定致病基因染色體定位確定致病基因染色體定位) )交換分析、連鎖不平衡分析交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析分子生物學(xué)分析染色體異常染色體異常( (缺失、易位等缺失、易位等) )分析、基分析、基因文庫(kù)的篩選與基因克隆因文庫(kù)的篩選與基因克隆整理課件（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略 由于基因組作圖的完成和分子病由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致基因產(chǎn)物

44、功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因。病基因。整理課件（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。致病基因。整理課件基因診斷和基因治療基因診斷和基因治療第九節(jié)第九節(jié)Gene Diagnosis and Gene Therapy整理課件n定義定義直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。從而對(duì)疾病作出診斷的方法。一、基因診斷一、基因診斷(Gene Diagnosis)(Gene Diagnosis)n特點(diǎn)特點(diǎn)以基因作為檢查材料和探察目標(biāo)，屬于以基因作為檢查材料和探察目標(biāo)，屬于“病因診斷病因診斷”。針對(duì)特定基因，特異性強(qiáng)。針對(duì)特定基因，特異性強(qiáng)。所用技術(shù)具有放大效應(yīng)，故診斷靈敏度高。所用技術(shù)具有放大效應(yīng)，故診斷靈敏度高。適用性強(qiáng)，診斷范圍廣。適用性強(qiáng)，診斷范圍廣。整理課件n DNADNA序列分析序列分析用于基因突變類型已經(jīng)明確的遺傳用于基因突變類型已經(jīng)明確的遺傳病的診斷及產(chǎn)