SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純度

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案SDS-PAG檢測(cè)蛋白質(zhì)純度1. 電泳的基本原理許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH及其組成。由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量的不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，因此，在一定時(shí)間內(nèi)，由于各組分移動(dòng)距離的不同，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。2. 影響電泳的主要因素2.1 電泳介質(zhì)的 pH 當(dāng)介質(zhì)的 pH等于某種兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該物質(zhì)處于等電狀態(tài)，即不向正極或負(fù)極移動(dòng)。當(dāng)介質(zhì)pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，則呈正離子狀態(tài)，移向負(fù)極；反之，介質(zhì)pH大于其等電點(diǎn)時(shí)，則呈負(fù)離子狀態(tài)，移向正極。因此,任何一種兩性物質(zhì)的混合物電 泳均

2、受介質(zhì)pH的影響，即決定兩性物質(zhì)的帶電狀態(tài)及其量，為了保持介質(zhì)pH的穩(wěn)定性，常用一定pH的緩沖液，如分離血清蛋白質(zhì)常用pH8. 6的巴比妥或三羥甲基氨基甲烷（ Tris ）緩沖液。2.2 緩沖液的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響是：離子強(qiáng)度低，電泳速度快，分離區(qū)帶不易清晰；離子強(qiáng)度高，電泳速度慢，但區(qū)帶分離清晰。如離子強(qiáng)度過低，緩沖液的緩沖量 小，不易維持pH的恒定；離子強(qiáng)度過高，則降低蛋白質(zhì)的帶電量（壓縮雙電層）使電脈速度減慢。所以常用離子強(qiáng)度為0.02-0.2之間。2.3 電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳速度成正比關(guān)系。電場(chǎng)強(qiáng)度以每厘米的電勢(shì)差計(jì)算，也稱 電勢(shì)梯度。如紙電泳的濾紙長(zhǎng)15cm,兩端電壓（

3、電勢(shì)差）為 150V,則電場(chǎng)強(qiáng)度為150/15=10V/cm ,電場(chǎng)強(qiáng)度愈高，則帶電粒子的移動(dòng)愈快。電壓增加，相應(yīng)電流也增大，電 流過大時(shí)易產(chǎn)生熱效應(yīng)可使蛋白質(zhì)變性而不能分離。2.4 電滲作用 在電場(chǎng)中，液體對(duì)固體的相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲。如濾紙中含有表面帶負(fù)電 荷的竣基，溶液則向負(fù)極移動(dòng)。 由于電滲現(xiàn)象與電泳同時(shí)存在，所以電泳的粒子移動(dòng)距離也受電滲影響，如紙上電泳蛋白質(zhì)移動(dòng)的方向與電滲現(xiàn)象相反，則實(shí)際上蛋白質(zhì)泳動(dòng)的距離， 等于電泳移動(dòng)距離減去電滲距離。如電泳方向和電滲方向一致，其蛋白質(zhì)移動(dòng)距離， 等于二者相加。電滲現(xiàn)象所造成的移動(dòng)距離可用不帶電有色染料或有色葡聚糖點(diǎn)在支持物的中間， 觀察電滲方向

4、和距離。2.5 對(duì)支持物的選擇一般要求支持物均勻，吸附力小，否則電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃描圖譜均無法重復(fù)。如紙電泳時(shí)，濾紙厚薄不均勻或吸附力過大，則蛋白質(zhì)或其他膠體顆粒在它們泳動(dòng)過程中有一部分被濾紙吸附，造成分離區(qū)帶蛋白含量相對(duì)量降低。因此，電泳前應(yīng)事先處理濾紙，以減低濾紙的吸附能力，可取得較好的分離效果。 若選用 Whatwan No. 1號(hào)濾紙或國(guó)產(chǎn)新華濾紙，一般不需要進(jìn)行預(yù)處理。2.6 溫度對(duì)電泳的影響電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦?fàn)枱?，熱?duì)電泳有很大的影響。溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)加劇，引起自由擴(kuò)散變快，遷移率增加。溫度每升高1度，遷移率約增加2.4%。為降低熱

5、效應(yīng)對(duì)電泳的影響，可控制電壓或電流，也可在電泳系 統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。3. 電泳的分類3.1 按分離原理分類 可分為區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳和聚焦電泳4種。1）區(qū)帶電泳 電泳過程中，不同的離子成分在均一的緩沖液中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，這是當(dāng)2）移界電泳 是Tiselius 最早建立的電泳，它是在U型管中進(jìn)行的，由于分離效果較差， 已為其它電泳技術(shù)所取代。3）等速電泳 需專用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相隨分成清晰的界面，并以等速移動(dòng)。4)等電聚焦由于具不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)中，自動(dòng)形成 pH梯度，使分離物移動(dòng)至各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶， 且分辨率較高。從表面看與區(qū)帶電

6、泳相似，但原理不同。3.2 區(qū)帶電泳的分類1) 按支持物物理性狀分類1. 濾紙及其他纖維素膜如乙酸纖維膜、玻璃纖維膜、聚胺纖維膜電泳。2. 粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳。3. 凝膠電泳，如瓊脂糖、瓊脂、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳。4. 絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。2) 按支持物的裝置形式不同分類1. 平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式。2 .垂直板式電泳。3 .連續(xù)流動(dòng)電泳，首先應(yīng)用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，緩沖液和 樣品自頂端下流，與電泳方向垂直?？煞蛛x較大量的蛋白質(zhì)。以后有用淀粉、纖維素粉、玻 璃粉等代替濾紙，分離效果更好。3) 按pH的連續(xù)

7、性不同分類1. 連續(xù)pH電泳：電泳全部過程中緩沖液pH保持不變。如紙電泳、乙酸纖維膜電泳。2. 不連續(xù)pH電泳：緩沖液與支持物之間有不同的pH,如聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳、等電聚焦電泳、等速電泳等，能使分離物質(zhì)區(qū)帶更加清晰，并可作ng級(jí)微量物質(zhì)的分離。不連續(xù)電泳與連續(xù)電泳的主要區(qū)別在于前者有兩層不同孔徑的凝膠系統(tǒng)；電極槽 中及兩層凝膠中所用的緩沖液pH值不同；電泳過程中形成的電位梯度亦不均勻。而后者在這三個(gè)方面都是單一或是均勻的。4) 幾種常見的電泳方法 4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis )是以聚丙烯酰胺凝膠作 為載

8、體的一種區(qū)帶電泳，這種凝膠由丙烯酰胺( acrylamide ,簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑 N N'- 甲叉基(亞甲基)雙丙烯酰胺(Nl, N' -methylene-bis-acrylamide ,簡(jiǎn)稱Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，透明，化學(xué)穩(wěn)定性高，無電滲作用，設(shè)備簡(jiǎn)單， 用樣量少(1-100 wg)和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例聚合成孔徑大小不同的凝膠，可用于蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分離、定性和定量分析。還可結(jié)合去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS,以測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量。聚丙烯酰胺的聚合反應(yīng)及其結(jié)構(gòu)8TC周辦鞏0Qjich3- Ah-

9、chz- in CHach 卡黑一ch-cchch.Sb單體任鏈)(Bia)CONHj conh -CHt CHCHj- UH CH., " in CHjCH .r 產(chǎn)WCoLh CONHtCONH CGMH,_%_也_ 4_鵬_胃_.人_*3 CONH I CH CONH.CONHCDNTLI1.-CHCHt- CH -CHSCH-HaCH-CHf-CH CONHCONHII. I三堆看歡搬戰(zhàn)如下:圖 APS 引發(fā)TEMEED!化Acr與Bis的聚合反應(yīng)Acr或Bis無論單獨(dú)存在或混合在一起都是穩(wěn)定的，一旦出現(xiàn)自由基團(tuán)時(shí)， 就會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)。自由基團(tuán)的引發(fā)有化學(xué)和光合兩種方法，化學(xué)

10、法的引發(fā)劑是過硫酸胺（簡(jiǎn)稱Aps）,催化劑為四甲基乙二胺（簡(jiǎn)稱TEMEID;光化學(xué)法是在光線照射下，由光敏感物質(zhì)核黃素來引發(fā)，催化劑也是 TEMED由于單體及交聯(lián)劑、引發(fā)劑和催化劑的濃度、比例、聚合條件等 的不同，便可產(chǎn)生不同孔徑的凝膠。一般而言，凝膠濃度愈大，交聯(lián)度愈大孔徑愈小。凝膠濃度的選擇與被分離物分子量及其性質(zhì)有關(guān)，其大致選用范圍如下表：表：分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍適用的凝月濃度（%蛋白質(zhì)< 10420 30_41 4X 1015 201 5X 1041X10510 1551 X 105 105> 5X102-5核酸（RNA< 10415 20104 10

11、55 101052X 1062 2.6根據(jù)凝膠形狀可分為盤狀電泳和板狀電泳。盤狀電泳是在直立的玻璃管內(nèi)，利用不連 續(xù)的緩沖液的pH值進(jìn)行電泳，同時(shí)，由于樣品混合物被分開后形成的區(qū)帶非常窄，呈圓盤 狀（discoid shape）,故而得名。板狀電泳（垂直或水平）是將丙烯酰胺聚合成方形或長(zhǎng)方 形平板狀，平板大小和厚度視實(shí)驗(yàn)需要而定。垂直平板電泳有如下優(yōu)點(diǎn)：表面積大，易于冷卻，便于控制溫度；能在同一凝膠板上，相同操作條件下，同時(shí)點(diǎn)加多個(gè)樣品，便于相 互比較；一個(gè)樣品在第一次電泳后，可將平板轉(zhuǎn)90度進(jìn)行第二次電泳即雙向電泳；便于用各種方法鑒定（如放射自顯影等）。其缺點(diǎn)是制備凝膠時(shí)操作較復(fù)雜，電壓較高

12、，電泳時(shí)間較長(zhǎng)。凝膠的機(jī)械性能，彈性、透明度和粘著度取決于凝膠總濃度。通常用T%表示總濃度，即100mL凝膠溶液中含有 Acr及Bis的總克數(shù)。Acr和Bis的比例常用交聯(lián)度 C%表示，即 交聯(lián)劑Bis占單體Acr和Bis總量的百分?jǐn)?shù)。凝膠的孔徑主要受總濃度 T%的控制。通常T%越大，平均孔徑越小，凝膠的機(jī)械強(qiáng)度 增加。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)T%值固定時(shí)，Bis濃度在5%時(shí)孔徑最小，高于或低于 5%時(shí)，孔徑卻相應(yīng)變大。為了在使用凝膠做實(shí)驗(yàn)時(shí)有較高的重現(xiàn)性，制備凝膠所用的Bis濃度，Bis和Acr的比例，催化劑的濃度，聚合反應(yīng)的溶液pH值，聚膠所需時(shí)間等，凡能影響泳動(dòng)率的因子都必須保持恒定。欲將蛋白質(zhì)或核

13、酸類大分子混合物很好地分離，并在凝膠上形成明顯的區(qū)帶，選擇一定孔徑的凝膠是關(guān)鍵。文獻(xiàn)中常見的標(biāo)準(zhǔn)凝膠是指濃度為7.5%,凝膠孔徑平均為5ns大多數(shù)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)在此標(biāo)準(zhǔn)凝膠中電泳均能得到滿意結(jié)果。不連續(xù)凝膠電泳的支持體由樣品膠、分離膠和濃縮膠組成。樣品膠為最上層；中層為 濃縮膠，一般 Acr為2%-3 %,緩沖液為不同濃度的Tris-HCl、pH為6.7左右；分離膠為最下層，Acr為5%-10%,緩沖液常用 Tris-HCl,pH 為8.9。上下電泳槽盛有 pH為8.3的 Tris-甘氨酸緩沖液，上電泳槽接電源的負(fù)極，下電泳槽接正極。不連續(xù)凝膠電泳的分離原理如下：1.樣品的濃縮效應(yīng)1 ）凝膠層

14、的不連續(xù)性：濃縮膠與分離膠中所用原料總濃度和交聯(lián)度不同，孔徑大小就 不同。前者孔徑大，后者孔徑小。帶電荷的蛋白質(zhì)離子在濃縮膠中泳動(dòng)時(shí)，因受阻力小，泳 動(dòng)速度快。當(dāng)泳動(dòng)到小孔徑的分離膠時(shí)，遇到阻力大，移動(dòng)速度逐步減慢，使樣品濃縮成很窄的區(qū)帶。2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性，最上層電極緩沖液中甘氨酸在pH 8.3時(shí)，可部分解離為NHCHCOQ三層膠中的緩沖液都是 Tris-HCl,HCl在各自pH條件下均被全部解離為 Cl-, 而在pH6.7時(shí)蛋白質(zhì)被解離帶負(fù)電（因大部分蛋白質(zhì) pI值為5.0左右，通電后，電極緩沖 液中的甘氨酸進(jìn)入濃縮膠緩沖液，pH由8.3變?yōu)?.7 ）,使甘氨酸解離度降低， 負(fù)電

15、荷減少，遷移率明顯下降（稱慢離子），相反Cl-處于解離狀態(tài)，且顆粒和摩擦力最小，其遷移率最大（稱快離子），結(jié)果在濃縮膠中，離子遷移率為Cl-蛋白質(zhì)-甘氨酸-。由于Cl-的快速移動(dòng)，使在Cl-后面膠層中的離子濃度驟然降低，形成一個(gè)低電導(dǎo)或稱高電位梯度（電位差）區(qū)域（電勢(shì)梯度E=電流弓II度I/電導(dǎo)率刀），因?yàn)殡娪舅俣热Q于電位差和有效遷移率，所以在此區(qū)域中，使蛋白質(zhì)離子及甘氨酸離子加速向陽(yáng)極移動(dòng)。當(dāng)快離子、慢離子和蛋白質(zhì)的遷移率與電位梯度的乘積彼此相等時(shí)，則3種離子移動(dòng)速度相同。在快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立之后，則在快離子和慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界 面。也就是

16、說，在高電位梯度和低電位梯度之間形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面（見圖24）。由于蛋白質(zhì)離子的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此就聚集在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮成很窄的薄層。此濃縮效應(yīng)使蛋白質(zhì)濃縮了數(shù)百倍。在分離膠層中，因緩沖液 pH為8.9,甘氨酸進(jìn)入此膠層后，其解離度大大增加，它的 遷移率幾乎與 Cl-接近。此外，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在泳動(dòng)時(shí)，所受阻力較濃縮膠中大， 移動(dòng)緩慢。由于這兩個(gè)原因，使甘氨酸離子在分離膠中有效遷移率超過蛋白質(zhì)離子，導(dǎo)致分離膠不具備濃縮膠效應(yīng)，而只有分離效應(yīng)。2 .分子篩效應(yīng)由于在凝膠電泳中，凝膠濃度不同，其網(wǎng)的孔徑大小也不同，可通過的蛋白質(zhì)分子量范圍也就不同。在分離膠

17、中孔徑較小，分子量和構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)分子， 通過一定孔徑的凝膠時(shí)所受阻力不同，從而引起泳動(dòng)速度的變化，所以多種蛋白質(zhì)即使所帶電荷相同，遷移率相等，在聚丙烯酰胺中經(jīng)一定時(shí)間泳動(dòng)后，也能彼此分開。大分子受阻程度大，走在后面，小分子受阻小，走在前面。3 .電荷效應(yīng)由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷不同，有效遷移率也不同，它們?cè)跐饪s膠和分離膠交界處被濃縮成狹窄區(qū)帶，仍以一定程序排列成各自的小圓盤狀，緊接在一起。當(dāng)它們進(jìn)入分離膠時(shí)，由于電泳體系已處于一個(gè)均一的連續(xù)狀態(tài)中，故此時(shí)以電荷效應(yīng)為主，帶不同電荷的蛋白質(zhì)離子按其移動(dòng)速度大小順次分離。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGEPAGE電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)分子（或

18、其它生物大分子）所帶電荷的差異及分子大小的不同 所產(chǎn)生的不同遷移率而分離成若干條區(qū)帶。然而有時(shí)兩個(gè)分子量不同的蛋白質(zhì)，由于其分子大小的差異、被它們所帶電荷的差別補(bǔ)償而以相同的速度向陽(yáng)極移動(dòng)，因而不能達(dá)到分離的目的。SDS-PAG蹴是設(shè)法將電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計(jì)的程度。SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合蛋白質(zhì)疏水部 分，形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一定條件下，SDSI大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4g SDS/1g蛋白質(zhì)。由于 SDS帶有負(fù)電荷，使各種 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的 量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同

19、蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀的影響，而只 與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。5.染色方法經(jīng)醋酸纖維薄膜、瓊脂（糖）、聚丙烯酰胺電泳分離的各種生物分子需用染色法使其在 支持物相應(yīng)位置上顯示出譜帶，從而檢測(cè)其純度、含量及生物活性。蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋 白、核酸及酶等均有不同的染色方法，現(xiàn)分別介紹如下： 5.1蛋白質(zhì)染色染色液種類繁多，各種染色液染色原理不同，靈敏度各異。使用時(shí)可根據(jù)需要加以選擇。常用的染色液有：1 .氨基黑10B氨基黑10B分子式為 G2H3N6&Nd, MW 715,入max=620-630nm,是酸性染料。其磺

20、酸基 與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料之一，但對(duì)SDS蛋白質(zhì)染色效果不好。另外，氨基黑10B染不同蛋白質(zhì)時(shí)，著色度不等、色調(diào)不一（有藍(lán)、黑、棕等） ；作同一凝 膠柱的掃描時(shí)，誤差較大，需要對(duì)各種蛋白質(zhì)作出本身的蛋白質(zhì)-染料量（吸收值）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，更有利于定量測(cè)定。2 .考馬斯亮藍(lán)R250考馬斯亮藍(lán) R250的分子式為 Ci4HwQHbS2Na, MW=824入max=560-590nm。染色靈敏度比 氨基黑高5倍。該染料是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，但蛋白質(zhì)濃度超過一定范圍時(shí)，對(duì)高濃度蛋白質(zhì)染色不合乎Beer定律，作定量分析時(shí)要注意這點(diǎn)。3 .考

21、馬斯亮藍(lán)G250考馬斯亮藍(lán) G250比R250多二個(gè)甲基。 MW=854,入max= 590-610 nmio染色靈敏度不如 R250,但比氨基黑高3倍。其優(yōu)點(diǎn)是在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地使蛋白質(zhì)染色而幾乎無本底色，所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。4 .固綠固綠分子式為 C37H1N2O0S3N&, MW： 808,入max=625 nm,酸性染料。染色靈敏度不如考馬斯亮藍(lán)，近似于氨基黑，但卻可克服考馬斯亮藍(lán)在脫色時(shí)易溶解出來的缺點(diǎn)。5 .熒光染料 略6 .銀染色法此法較考馬斯亮藍(lán)靈敏 100倍。但染色機(jī)制尚不清楚，可能與攝影過程中Ag+的還原相似。7 .廣

22、譜染料（stains-all ）染色法5.2 糖蛋白染色1 . 過碘酸-Schiff 試劑2 .阿爾山藍(lán)染色5.3 脂蛋白染色1 .油紅O染色2 .蘇丹黑B實(shí)驗(yàn)一 SDS-PAGE凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的純度目的要求學(xué)習(xí)SDS-PAGEW定蛋白質(zhì)純度的原理和方法；掌握SDS-PAGE勺其他應(yīng)用原理SDS PAG提PAGE勺一種特殊形式，有關(guān)理論如上所述。SDS 是帶負(fù)電荷的陰離子去污劑。用SDS-PAGE定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，蛋白質(zhì)需經(jīng)樣品 溶解液處理。在樣品溶解液中含有萌基乙醇及 SDS各種蛋白質(zhì)樣品在前基乙醇作用下還原 成單鏈，再進(jìn)一步與 SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此各

23、種蛋白質(zhì)分 子在SDS- PAG可，只能按其分子量大小而分離。SDS - PAGEW連續(xù)體系及不連續(xù)體系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩沖液， 但加樣方式，電泳過程及固定、染色與脫色方法完全相同。操作步驟一、安裝夾心式垂直板電泳槽1 .裝上貯槽和固定螺絲釘，仰放在桌面上。2 .將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到硅橡膠框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。3 .將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。4 .將下貯槽的銷孔對(duì)準(zhǔn)以裝好螺絲釘?shù)纳腺A槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽。5 .豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂，以封住空隙，加瓊脂溶液時(shí)，應(yīng)

24、防止氣泡進(jìn)入。二、配膠及凝膠板的制備1 .配膠 根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。由于SDS- PAGEW連續(xù)系統(tǒng)及不連續(xù)系統(tǒng)兩種，兩者間有不同的緩沖系統(tǒng)，因而有不同的配制方法，見表1、2。表1SDS-不連續(xù)體系凝膠配制試劑名稱20mL分離膠所需試劑用量(mD濃縮膠試劑用量5%7.5%10%15%5%分離膠貯液 30%Acr-0.8%Bis3.335.006.6610.000.65ml分離膠緩沖液pH8.9 Tris-HCl2.502.502.502.50濃縮膠貯液 10%Acr-0.5%Bis濃縮膠緩沖液pH6.7 Tris-HCl1.00ml10%SDS0.200.200.2

25、00.200.08ml1%TEMED2.002.002.002.00TEME晾?5uL雙蒸水11.8710.28.545.2050%T油 2.3mL10%APS0.100.100.100.100.06 mL電極緩沖液為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖1夜,內(nèi)含 0.1%SDS表2 略2 .凝膠板的制備(1) SDS-不連續(xù)體系凝膠板的制備分離膠的制備： 按表1配制20 mL7.5%聚丙烯酰胺，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約 8cm高，用1mL移液器取少許水飽和正丁醇，沿長(zhǎng)玻璃 板板壁緩慢注入，約 3-4mm高，以隔離空氣。約30min后，凝膠與水飽和正丁醇層間出現(xiàn)折

26、射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水飽和正丁醇，再用濾紙條吸去多余水分。濃縮膠的制備：按表1濃縮膠配制方法配制 4mL 5%聚丙烯酰胺，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約 0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約 30 min后凝膠聚合。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中 多余的水分，將 pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上,即可準(zhǔn)備加樣。三、樣品的處理與加樣1 .樣品的處理根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液；自己配制標(biāo)準(zhǔn)及未知樣品，按0.5-1mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移

27、到帶塞小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時(shí)迸出），在100c沸水浴中保溫3min,取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫 時(shí)不用，可放在-20 C冰箱保存較長(zhǎng)時(shí)間，使用前在100c沸水中加熱3min,以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。2 .加樣一般每個(gè)凹形樣品槽內(nèi)，只加一種樣品或已知分子量的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，加樣體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10-15 L （即2-10 pg蛋白）。如樣品較稀，加樣體積可達(dá)100 pL。如樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭排除。加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器， 注意針頭勿碰破凹形槽膠面。由于樣品溶解液

28、中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層。四、電泳不連續(xù)系統(tǒng)：在電極槽中倒入 pH8.3 Tris- 甘氨酸電極緩沖液，內(nèi)含 0.1 % SDS即可進(jìn)行電泳。電 泳條件：開始時(shí)電流為 10mA左右，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為 20-30mA,當(dāng)染料前沿距硅 橡膠框底邊1.5cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。五、凝膠板剝離與固定電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用不銹鋼藥鏟或鐐子撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標(biāo)志。將凝膠板放在大培養(yǎng)皿內(nèi)。六、染色與脫色將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h左右，用蒸儲(chǔ)水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。七

29、、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離（cm）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（cm）。按下式計(jì)算相對(duì)遷移率 RR：相對(duì)遷移率mR =蛋白樣品距加樣端距離/澳酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)未知蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子 量。注意事項(xiàng)1. SDS屯度2. SDS與蛋白的結(jié)合量3 .凝膠濃度：應(yīng)根據(jù)未知樣品的估計(jì)分子量，選擇凝膠濃度。分子量在 25 000- 200 000的蛋白質(zhì)選用終濃度為 5%的凝膠；分子量在10000 70000的蛋白

30、質(zhì)選用終濃度為 10% 的凝膠；分子量在1000050000的蛋白質(zhì)選用終濃度為 15%的凝膠，在此范圍內(nèi)樣品分子 量的對(duì)數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系。以上各種凝膠濃度其交聯(lián)度都應(yīng)是2.6%。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率最好在0.2 -0.8之間均勻分布。用此法測(cè)定的分子量只是它們的亞基或單條肽鍵的分子量，而不是完整的分子量。為測(cè)得精確的分子量范圍，最好用其他測(cè)定蛋白分子量的方法加以校正。此法對(duì)球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測(cè)定較好，對(duì)糖蛋白，膠原蛋白等分子量測(cè)定差異較大。4 .對(duì)樣品的要求：應(yīng)采用低離子強(qiáng)度的樣品。如樣品中離子強(qiáng)度高，則應(yīng)透析或經(jīng)離 子交換除鹽。加樣時(shí)，應(yīng)保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以1015 L為宜，如樣品系較稀的液體，為保證區(qū)帶清晰，加樣量可增加，同時(shí)應(yīng)將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。5 .由于凝膠中含SDS直接制備干板會(huì)產(chǎn)生龜裂現(xiàn)象。試劑1 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)目前國(guó)內(nèi)外均有廠商生產(chǎn)低分子量及高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)成套試劑盒，用于SDS- PAGEIU定未知蛋白質(zhì)分子量。2 .不連續(xù)體系SDS- PAGE1關(guān)試齊IJ(1) 10%SDS溶液：稱5g SDS加雙蒸水至50 mL微熱使其溶解，置試劑瓶中，4c貯存。用前微熱，使 SDS完全溶解。(2)1% TEME