RT-PCR結(jié)合地高辛標(biāo)記定量檢測猴免疫缺陷病毒RNA

1、    RT-PCR 結(jié)合地高辛標(biāo)記定量檢測 猴免疫缺陷病毒 RNA        摘要：從感染猴免疫缺陷病毒(SIV)的恒河猴血漿和培養(yǎng)細(xì)胞株中分別純化病毒 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增SIV gag基因特異的 DNA 片段。將 RT-PCR 產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記，檢測靈敏度比凝膠電泳和斑點雜交提高 100 倍。用已知拷貝數(shù)的 RNA 作為定量標(biāo)準(zhǔn)，可估計待測樣本中 SIV RNA 的拷貝數(shù)。主題詞：SIV/免疫學(xué)；聚合酶鏈反

2、應(yīng)；遺傳標(biāo)記；地高辛/診斷應(yīng)用中分類號：R446.61文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3213(1999)01-0066-03Quantitative Detection of Simian Immunodeficiency Virus RNA by RT-PCR Combined with Digoxin LabelingCHEN Zheng-tu，ZENG Qing-ping，F(xiàn)U Lin-chun(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)Abstract:A simia

3、n immunodeficiency virus(SIV)gag gene-specific DNA fragment was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)of RNA purified from the serum of SIV-infected marcaque monkey and a cultured cell line. The detection sensitivity of RT-PCR products by digoxin labeling was 100 folds

4、as that by gel electrophoresis and dot blotting. The copy number of SIV RNA to be measured could be estimated by using a standard RNA whose copy number was known.Key words:SIV/immunology;POLYMERASE CHAIN REACTION;GENETIC MARKERS;DIGOXIN/diag.use猴艾滋病模型1是當(dāng)今國際公認(rèn)的評價艾滋病治療藥物與疫苗療效及安全性的最佳實驗動物模型，俗有“黃金標(biāo)準(zhǔn)”(gol

5、d standard) 之稱2。對用藥后艾滋病模型猴外周血中猴免疫缺陷病毒(SIV) RNA 的定時、定量、動態(tài)監(jiān)測是正確評價藥物療效的重要環(huán)節(jié)之一，也是目前國際上公認(rèn)的病毒負(fù)荷檢測指標(biāo)。以往采用競爭性聚合酶鏈反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (PCR/RT-PCR) 對 DNA/RNA 進行定量檢測時，常因凝膠分辨力差或顯示信號不足而導(dǎo)致檢測靈敏度下降，有時還得出“假陰性”結(jié)果。為此，我們采用 RT-PCR 結(jié)合高效地高辛標(biāo)記的雙重放大技術(shù)檢測 SIV RNA，檢測靈敏度大幅度提高，重復(fù)性好，適合進行大樣本中 SIV RNA 的定量測定，為今后開發(fā)高效、實用的 DNA/RNA 定量檢測試劑盒打下了良

6、好的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1SIV 核酸提取  感染 SIVmac251 的恒河猴血漿和感染 SIVmac 的CEMx174 細(xì)胞由本所吳小閑教授提供。采用德國寶靈曼公司病毒核酸提取試劑盒提取 SIV RNA/DNA，所用樣本量為 200 L，核酸提取產(chǎn)物定容為 50 L。1.2RT-PCR 擴增SIV gag 上游引物為5AATGAGGAGGCTGCAGATTGGGACTTG3，下游引物為 5GCACTATCTTGCAATCTGGGTTAGC3，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所合成。擴增反應(yīng)條件為 48 ，45 s，94 ，2 min，然后94 ，30 s，60 ，1 min，68

7、，2 min，循環(huán) 40 次，最后 68 ，7min。所用標(biāo)本量為 2 L。標(biāo)準(zhǔn) RNA 及其擴增引物均購自美國普羅麥格公司。采用英國 UVP GDS-760 凝膠聯(lián)機成像系統(tǒng)檢測擴增產(chǎn)物。1.3地高辛標(biāo)記與斑點雜交采用德國寶靈曼公司的地高辛試劑盒及尼龍膜進行標(biāo)記、雜交。1.4探針純化按美國普羅麥格公司 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說明書操作。2結(jié)果2.1凝膠電泳檢測靈敏度將標(biāo)準(zhǔn) RNA 的RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)倍比稀釋后進行凝膠電泳，結(jié)果只在稀釋 10 倍和 102 倍時檢出特異性擴增帶(1)。    1RT-PCR 擴增產(chǎn)物稀釋后電泳譜1.擴增產(chǎn)物原液；2.

8、10倍稀釋液；3.102倍稀釋液結(jié)果表明，凝膠電泳檢測 RT-PCR 產(chǎn)物的分辨力較低，即使采用先進的凝膠聯(lián)機成像系統(tǒng)，也只能檢測稀釋 102 倍的擴增產(chǎn)物。2.2地高辛標(biāo)記 RT-PCR 產(chǎn)物的顯色靈敏度在對 106 拷貝的標(biāo)準(zhǔn) RNA 進行 RT-PCR 擴增后，經(jīng)地高辛標(biāo)記、稀釋和顯色，結(jié)果如2所示。    2地高辛標(biāo)記擴增產(chǎn)物的檢測靈敏度1.標(biāo)記產(chǎn)物原液；2.10倍稀釋液；3.102倍稀釋液；4.103倍稀釋液；5.104倍稀釋液結(jié)果表明，RT-PCR 擴增后標(biāo)記產(chǎn)物稀釋 104 倍后仍能顯色，檢測靈敏度比凝膠電泳提高了 100 倍。根據(jù)起始拷貝

9、數(shù)( 106拷貝)推算，可檢出的 RNA 為 102拷貝。將編號為 115 的猴血漿和感染 SIV 的 CEMx174 細(xì)胞的 RT-PCR 產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記，純化后與標(biāo)準(zhǔn) RNA 的 RT-PCR 標(biāo)記產(chǎn)物共同顯色，結(jié)果從細(xì)胞和血漿標(biāo)本中分別可檢出稀釋 103 倍和 104 倍的 SIV RNA (3)。    3地高辛標(biāo)記擴增產(chǎn)物的定量A.細(xì)胞樣本；B.血漿樣本；C.標(biāo)準(zhǔn)；1.原液；2.10倍稀釋液；3.102倍稀釋液；4.103倍稀釋液；5.104倍稀釋液以最低檢測閾值為 102拷貝計算，可反推出細(xì)胞和血漿標(biāo)本中所含 SIV RNA 分別為 10?

10、5 拷貝 和106 拷貝。按濃縮比為 250 計算，兩樣本實際 SIV RNA 濃度分別為 2.5×107/ mL和 2.5×108/ mL。2.3RT-PCR 產(chǎn)物的斑點雜交用地高辛標(biāo)記的來自 CEMx174 細(xì)胞的 RT-PCR 產(chǎn)物作探針，分別與上述血漿和細(xì)胞來源的經(jīng)過倍比稀釋的 RT-PCR 產(chǎn)物雜交，結(jié)果如 4 所示。    4RT-PCR 擴增產(chǎn)物的斑點雜交A.標(biāo)準(zhǔn)；B.血漿樣本；C.細(xì)胞樣本；1.106拷貝；2.105拷貝；3.104拷貝；4.103拷貝；5.102拷貝由 4 可見，在 102 稀釋倍數(shù)以下雜交呈陽性，而

11、在 103 倍以上則呈陰性。由起始拷貝數(shù)可知，雜交只能檢測到 104 拷貝以上的 RNA。3討論血漿病毒 RNA水平是檢測體內(nèi)病毒負(fù)荷的常用手段，也是評價藥物療效的重要之一。然而，常用的核酸定量技術(shù)PCR/RT-PCR 一般采用凝膠電泳檢測其擴增產(chǎn)物，當(dāng)起始 RNA 以及隨后的擴增產(chǎn)物濃度較低時，可能會因為凝膠電泳的分辨力差而出現(xiàn)漏檢(假陰性)。因此，無論是采用凝膠成像系統(tǒng)檢測還是電泳后進行目測比較，檢測結(jié)果的分析都會受到凝膠分辨力的限制。為了有效地提高檢測水平，我們將 RT-PCR 產(chǎn)物用“高效引導(dǎo)”(high-prime) 地高辛標(biāo)記和顯色系統(tǒng)加以檢測，結(jié)果在RT-PCR 產(chǎn)物稀釋 104

12、 倍后仍能顯色，使檢出 RNA 的靈敏度從 104 拷貝提高到 102 拷貝，提高幅度高達 100 倍左右，接近質(zhì)控定量 PCR (QC-PCR) 的檢測水平 3。用已知拷貝數(shù)的 RNA 作為參比標(biāo)準(zhǔn)，通過平行的 RT-PCR 擴增和擴增后標(biāo)記及顯色，即可估計待測樣本中的 RNA 拷貝數(shù)。這一研究結(jié)果為進一步開發(fā)靈敏有效和經(jīng)濟實用的 PCR/RT-PCR 定量檢測試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。另外 ，地高辛標(biāo)記比同位素標(biāo)記需時更短，操作更簡單和更安全，二者的檢測靈敏度相近，故地高辛的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛。鑒于斑點雜交的檢測水平與凝膠電泳相當(dāng)，故 RT-PCR 產(chǎn)物的定量不必采用操作較為復(fù)雜的分子雜交法

13、。但是，在定量測定前先采用雜交法排除假陽性，將能確保定量測定結(jié)果的可靠性。基金項目：國家自然科學(xué)基金資助課題(39870725)和廣東省自然科學(xué)基金資助課題(980642)作者簡介：陳征途，女，實驗師；作者單位：陳征途（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）曾慶平（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）符林春（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）參考文獻：1盧耀增，吳小閑，涂新明，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建立J.中國實驗動物學(xué)報，1994，2(2)：942Esparza J, Osmanov S. A summary of the WHO informal consultation on animal models for evaluaion of drugs and vaccines for HIV infection and AIDS A.In： Schellekens H,Horzinek M C.