蛋清溶菌酶的制備及活力測定

1、蛋清溶菌酶的制備及活力測定一、 實驗目的1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力測定方法。二、實驗原理溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用于細菌細胞壁的粘多糖，具有殺菌等作用，廣泛應用于醫(yī)學臨床。溶菌酶存在于植物漿及動物(蛋清、血漿、淋巴液和鼻粘膜等處)組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實驗室及實際生產中一般以雞蛋清為原料進行溶菌酶的提取制備。從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實驗采用的分離純化步驟為：等電點及熱變性選擇性沉淀聚丙烯酸處理葡聚糖凝膠柱層析聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性

2、條件下經受長時間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點，因此采用熱變性與等電點沉淀相結合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚蛋白質，在酸性條件下可以與溶菌酶結合形成凝聚物；當有鈣離子存在時溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來，同時生成丙烯酸鈣沉淀，后者經過硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在實驗中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結合，所形成的凝聚物會立即粘附于試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最后再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開。三、儀器和試劑儀器玻璃層析柱(2.5cm×34cm)、電熱恒溫水浴鍋、離心沉淀機、10L 微量進樣器

3、、721型分光光度計。試劑1. Sephadex G-502. 1%NaCl0.05mol/LHCl3. 20%HAc4. 10%聚丙烯酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)5. 0.5mol/LNa2CO36. 500g/LCaCl27. NaCl8. 6g/LNaCl9. 飽和草酸溶液；10. 細菌懸液：取1g 艷紅K-2BP 標記的微球菌M.lysodeikticus 懸于100mL0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液中，置于冰箱內保存?zhèn)溆谩?1. 乳化劑：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL 蒸餾水微熱使溶解，冷卻后定容至100mL。吸取此液10mL 用0.6mol/LHCl 定容至200m

4、L 備用。12. 0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液。四、操作步驟(一)蛋清溶菌酶的分離提取1.變性與等電點選擇性沉淀：取新鮮蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液攪拌稀釋，加20%HAc 調至pH4.6，3000r/min 離心10min，收集濾液并記錄體積，留樣2mL()待分析。將濾液置于沸水浴使3min 內迅速升溫至75，用流動水速冷后，3000r/min 離心20min，收集上清液，紀錄體積，并留樣2mL()待分析。2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當凝聚物出現(xiàn)后，靜置30min 使凝聚物粘附于容器底

5、部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進行離心或簡單過濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。3.Sephadex G-50 柱層析(1)裝柱：稱取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸餾水溶脹6小時以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡層析柱。(2)上樣：向樣液中加入固體NaCl 使終濃度

6、為50g/L，上樣時先吸去層析柱凝膠面上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過10mL。加完后打開層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內。(3)洗脫：樣品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脫液洗下柱壁上的樣品，然后接通蠕動泵，繼續(xù)6g/LNaCl 洗脫，調節(jié)操作壓力使流速控制在78mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。(4)分析：紀錄各管體積，紫外光吸收法測定各管中蛋白質濃度。合并含有蛋白質的收集管，草酸鑒定Ca2+ ，留樣()待分析。4.乙二醇濃縮：將洗脫液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加蓋容器中。當酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮至5mL 左右時，

7、用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出濃縮液，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。(二)溶菌酶活力測定取上述各待測酶液稀釋3050倍，進行酶活測定。用微量進樣器取酶液樣品10L，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸緩沖液(pH6.5)，混合均勻，37預熱2min，然后加入同樣已預熱過的菌懸液0.5mL。37保溫反應15min 后，用2mL 乳化劑停止反應。反應液經3000r/min 離心10min，取清液在721型分光光度計上進行比色(540nm)。空白管用磷酸緩沖液替代樣液。1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力測定方法。二、實驗原理溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰

8、胞壁質聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用于細菌細胞壁的粘多糖，具有殺菌等作用，廣泛應用于醫(yī)學臨床。溶菌酶存在于植物漿及動物(蛋清、血漿、淋巴液和鼻粘膜等處)組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實驗室及實際生產中一般以雞蛋清為原料進行溶菌酶的提取制備。從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實驗采用的分離純化步驟為：等電點及熱變性選擇性沉淀聚丙烯酸處理葡聚糖凝膠柱層析聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性條件下經受長時間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點，因此采用熱變性與等電點沉淀相結合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚蛋白質，

9、在酸性條件下可以與溶菌酶結合形成凝聚物；當有鈣離子存在時溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來，同時生成丙烯酸鈣沉淀，后者經過硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在實驗中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結合，所形成的凝聚物會立即粘附于試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最后再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開。三、儀器和試劑儀器玻璃層析柱(2.5cm×34cm)、電熱恒溫水浴鍋、離心沉淀機、10L 微量進樣器、721型分光光度計。試劑1. Sephadex G-502. 1%NaCl0.05mol/LHCl3. 20%HAc4. 10%聚丙烯酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)5.

10、0.5mol/LNa2CO36. 500g/LCaCl27. NaCl8. 6g/LNaCl9. 飽和草酸溶液；10. 細菌懸液：取1g 艷紅K-2BP 標記的微球菌M.lysodeikticus 懸于100mL0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液中，置于冰箱內保存?zhèn)溆谩?1. 乳化劑：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL 蒸餾水微熱使溶解，冷卻后定容至100mL。吸取此液10mL 用0.6mol/LHCl 定容至200mL 備用。12. 0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液。四、操作步驟(一)蛋清溶菌酶的分離提取1.變性與等電點選擇性沉淀：取新鮮蛋清用1%NaCl-0.

11、05mol/LHCl 溶液攪拌稀釋，加20%HAc 調至pH4.6，3000r/min 離心10min，收集濾液并記錄體積，留樣2mL()待分析。將濾液置于沸水浴使3min 內迅速升溫至75，用流動水速冷后，3000r/min 離心20min，收集上清液，紀錄體積，并留樣2mL()待分析。2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當凝聚物出現(xiàn)后，靜置30min 使凝聚物粘附于容器底部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體

12、積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進行離心或簡單過濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。3.Sephadex G-50 柱層析(1)裝柱：稱取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸餾水溶脹6小時以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡層析柱。(2)上樣：向樣液中加入固體NaCl 使終濃度為50g/L，上樣時先吸去層析柱凝膠面上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過10mL。加完后打開層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內。(3)洗脫：樣品流完后

13、，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脫液洗下柱壁上的樣品，然后接通蠕動泵，繼續(xù)6g/LNaCl 洗脫，調節(jié)操作壓力使流速控制在78mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。(4)分析：紀錄各管體積，紫外光吸收法測定各管中蛋白質濃度。合并含有蛋白質的收集管，草酸鑒定Ca2+ ，留樣()待分析。4.乙二醇濃縮：將洗脫液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加蓋容器中。當酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮至5mL 左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出濃縮液，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。(二)溶菌酶活力測定取上述各待測酶液稀釋3050倍，進行酶活測定。用微量進樣

14、器取酶液樣品10L，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸緩沖液(pH6.5)，混合均勻，37預熱2min，然后加入同樣已預熱過的菌懸液0.5mL。37保溫反應15min 后，用2mL 乳化劑停止反應。反應液經3000r/min 離心10min，取清液在721型分光光度計上進行比色(540nm)?？瞻坠苡昧姿峋彌_液替代樣液。一、實驗目的1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力測定方法。二、實驗原理溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用于細菌細胞壁的粘多糖，具有殺菌等作用，廣泛應用于醫(yī)學臨床。溶菌酶存在于植物漿及動物(蛋清、血漿、淋

15、巴液和鼻粘膜等處)組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實驗室及實際生產中一般以雞蛋清為原料進行溶菌酶的提取制備。從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實驗采用的分離純化步驟為：等電點及熱變性選擇性沉淀聚丙烯酸處理葡聚糖凝膠柱層析聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性條件下經受長時間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點，因此采用熱變性與等電點沉淀相結合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚蛋白質，在酸性條件下可以與溶菌酶結合形成凝聚物；當有鈣離子存在時溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來，同時生成丙烯酸鈣沉淀，后者經過硫酸的酸化又重新形成聚丙

16、烯酸。在實驗中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結合，所形成的凝聚物會立即粘附于試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最后再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開。三、儀器和試劑儀器玻璃層析柱(2.5cm×34cm)、電熱恒溫水浴鍋、離心沉淀機、10L微量進樣器、721型分光光度計。試劑1.SephadexG-502.1%NaCl0.05mol/LHCl3.20%HAc4.10%聚丙烯酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)5.0.5mol/LNa2CO36.500g/LCaCl27.NaCl8.6g/LNaCl9.飽和草酸溶液；10.細菌懸液：取1g艷紅K-2BP標記的微球菌M.l

17、ysodeikticus懸于100mL0.5mol/L的pH6.5磷酸緩沖液中，置于冰箱內保存?zhèn)溆谩?1.乳化劑：2gBrij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL蒸餾水微熱使溶解，冷卻后定容至100mL。吸取此液10mL用0.6mol/LHCl定容至200mL備用。12.0.5mol/L的pH6.5磷酸緩沖液。四、操作步驟(一)蛋清溶菌酶的分離提取1.變性與等電點選擇性沉淀：取新鮮蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl溶液攪拌稀釋，加20%HAc調至pH4.6，3000r/min離心10min，收集濾液并記錄體積，留樣2mL()待分析。將濾液置于沸水浴使3min內迅速升溫至75，用流動水

18、速冷后，3000r/min離心20min，收集上清液，紀錄體積，并留樣2mL()待分析。2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當凝聚物出現(xiàn)后，靜置30min使凝聚物粘附于容器底部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進行離心或簡單過濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。3.SephadexG-50柱層析(1)裝柱：稱取15gSephadexG-50，加入300mL蒸餾水溶脹6