紫外分光光度法對(duì)嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的測定方法研究

1、中國食品添加劑分析測試ChinaFoodAdditives紫外分光光度法對(duì)嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的測定方法研究歐英杰,曾暖茜,馮志強(qiáng),許佩勤211(1.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,廣州󰀁510308;2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室,廣州󰀁510308)󰀁󰀁摘󰀁要:木瓜蛋白酶具有分解蛋白為氨基酸的能力,是市場上嫩肉粉的主要成分。本文通過測定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小,為判斷嫩肉粉質(zhì)量優(yōu)劣提供參考依據(jù)。把嫩肉粉溶于鹽酸半胱氨酸溶液,取該混合液與酪蛋白溶液反應(yīng)10min,用紫外分光光度法測得反應(yīng)所生成酪氨酸的含量。該方法

2、具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性,添加標(biāo)準(zhǔn)回收率為96󰀁8%105󰀁8%;且步驟簡明,所需測試儀器簡單。在該方法條件下,每分鐘水解酪蛋白生成1󰀁g酪氨酸所需樣品的量為1個(gè)酶活力單位。此種酶活力表述方式亦為國內(nèi)關(guān)于各種酶活力的表述所常用,便于酶活力數(shù)據(jù)的比較與換算。通過測定,發(fā)現(xiàn)市售各種嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力參差不齊,則嫩肉粉對(duì)肉類的嫩化能力強(qiáng)弱亦有差別,體現(xiàn)在使用添加量的多少和對(duì)肉類浸泡時(shí)間的長短上。也有發(fā)現(xiàn)酶活力為0的,說明該產(chǎn)品中的木瓜蛋白酶已失去活力,或者根本沒有添加木瓜蛋白酶,屬于偽劣商品。關(guān)鍵詞:紫外分光光度法;嫩肉粉;木瓜蛋白酶;酶活力中

3、圖分類號(hào):TS207󰀁3󰀁󰀁󰀁文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A󰀁󰀁󰀁文章編號(hào):1006-2513(2010)02-0214-03Determinationofpapain󰀂senzymeactivityinmeattenderizerbyUVspectrophotometryOUYing󰀂jie,ZENGNuan󰀂xi,FENGZhi󰀂qiang,XUPei󰀂qin1211(1.GuangdongFoodQualitySu

4、pervisionandInspectionStation,Guangzhou510308;2.GuangdongProvincialPublicLaboratoryofFoodIndustry,Guangzhou510308)Abstract:Papaincandecomposeproteinintoaminoacidsandistheessentialingredientofmeattenderizer.Thispaperstudiedthedeterminationofpapains'enzymeactivityinmeattenderizer.Theresultscanbeus

5、edforestimatingthequal󰀂ityofmeattenderizer.DissolvemeattenderizerinL-cysteinehydrochloridemonohydratesolution,mixthemeatten󰀂derizersolutionandcaseinsolutionforchemicalreaction10minutesanddetectthecontentofreactionproducttyrosinebyUVSpectrophotometry.Thismethodjustneedssimpleequipment

6、andisconvenient,accurateandpractica.lThetheamountofmeattenderizerfordecomposingcaseinintorecoveryratewas96󰀁8%105󰀁8%.Undertheconditions,usedinhome,1󰀁gtyrosineperminuteisdefinedoneenzymeactivityunit.Thiskindofdefinitionaboutenzymeactivityisusuallysothedataisconvenientforcompare

7、andconversion.Afterdetermination,wefoundtheenzymeactivitydifferentmeattenderrizershaddifferentan󰀂ortheofpapainindifferentmeattenderizerssoldinmarketweredifferent,andthetendercapabilityofmeattenderizerswerealsodifferent.Sohowmuchtouseandhowlongtomarinatethemeat,swers.Wealsofoundsomeenzymeacti

8、vitywaszero,meattenderizerhadnotaddedpapain.Keywords:UVspectrophotometry;meattenderizer;papain;收稿日期:2009-05-08作者簡介:歐英杰(1982-),男,本科,研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。thatindicatedthepapainhadlostitsenzymeactivity,enzymeactivity214󰀁分析測試中國食品添加劑ChinaFoodAdditives木瓜蛋白酶(PapainEC3󰀁4󰀁22󰀁2)屬于巰基蛋白酶,可水

9、解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端,并能優(yōu)先水解在肽鏈的N端具有2個(gè)羧基的氨基酸或芳香L氨基酸(如酪氨酸)的肽鍵。其最適作用pH為5󰀁07󰀁0,在中性或偏堿性時(shí)亦有作用,耐熱性強(qiáng)1稀釋到500mL,用前配制。三氯乙酸溶液:取三氯乙酸1󰀁8g,加乙酸鈉2󰀁99g和冰乙酸1󰀁9mL,加水溶解并稀釋至100mL。1󰀁3󰀁對(duì)照品和樣品的處理對(duì)照品溶液的制備:精密稱取已在105!干燥至恒重的酪氨酸對(duì)照品適量,用0󰀁1mol/L鹽酸溶液制成每mL中約含40󰀁g

10、的溶液。供試品溶液的制備:取嫩肉粉約0󰀁5g,精密稱定,加酶稀釋液攪拌,稀釋至100mL。1󰀁4󰀁測定法準(zhǔn)確量取供試品溶液各1󰀁0mL,分別置于2支10mL具塞試管中,于(37 0󰀁2)!水浴預(yù)熱5min,準(zhǔn)確加入(37 0󰀁2)!預(yù)熱的底物溶液5󰀁0mL,立即振搖,置(37 0󰀁2)!水浴中,精確反應(yīng)10min后,加三氯乙酸溶液5󰀁0mL,振搖,于(37 0󰀁2)!水浴中放置40min,用干燥濾紙過濾,濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為

11、空白,在275nm的波長處測定吸收度A;再精確量取供試品溶液1󰀁0mL,置于10mL具塞試管中,于(37 0󰀁2)!水浴預(yù)熱5min,加入三氯乙酸溶液5mL,振搖,置(37 0󰀁2)!水浴中,反應(yīng)10min后,準(zhǔn)確加入(37 0󰀁2)!預(yù)熱的底物溶液5󰀁0mL,振搖,于(37 0󰀁2)!水浴中放置40min,用干燥濾紙過濾,濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為空白,在275nm的波長處測定吸收度A0。另取酪氨酸對(duì)照溶液,以0󰀁1mol/L鹽酸溶液為空白,在275nm處測定吸收度An。1&

12、#983041;5󰀁結(jié)果計(jì)算W3A-A011n1000W10An。目前市場上嫩肉粉的成分主要是木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶通過分解膠原蛋白、彈性蛋白,降解膠原纖維和結(jié)締組織蛋白成為小分子的多肽甚至氨基酸,令肌肉肌絲和腰筋絲斷裂,因此嫩肉粉能使老牛肉、豬肚、臘肉等較堅(jiān)韌肉類迅速嫩化,有利消化并提高營養(yǎng)價(jià)值,并可節(jié)省烹調(diào)時(shí)間與能源,適合飯店、賓館及家庭使用2。酶活力是酶性質(zhì)的重要參數(shù),顯示酶分解底物能力的強(qiáng)弱。木瓜蛋白酶酶活力的測定,采用不同底物衍生的測定方法也不同,所取得的數(shù)值也不能進(jìn)行直接比較。傳統(tǒng)的作法,木瓜蛋白酶是用明膠或血紅蛋白作底物來測定的。由于要求底物具有較高的專一性和便于

13、標(biāo)準(zhǔn)化,新的測定方法往往采用合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)3。但以BAEE為底物的測定方法所涉4及到的儀器設(shè)備昂貴,成本偏高。本文采用以酪蛋白為底物的紫外光譜法來測定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力,該法所需測試儀器簡單,步驟簡明,容易掌握;并且該法也常被國內(nèi)用來測定各種酶的活力,所得的數(shù)據(jù)便于比較。對(duì)嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的測定,可為嫩肉粉質(zhì)量優(yōu)劣提供一項(xiàng)重要的參考指標(biāo)。1󰀁實(shí)驗(yàn)部分1󰀁1󰀁儀器恒溫水浴鍋;751-GW分光光度計(jì)。1󰀁2󰀁試劑酪蛋白溶液:取酪蛋白0󰀁6g,加0󰀁

14、;05mol/L磷酸氫二鈉溶液80mL,置沸水浴中煮30min,時(shí)時(shí)攪拌,冷至室溫,加0󰀁1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7󰀁0 0󰀁1,用水稀釋至100mL,用前配制。酶稀釋液:取鹽酸半胱氨酸2󰀁635g,氯化鈉11󰀁7g,加水250mL溶解,另取乙二胺四乙酸二鈉1󰀁115g,加水100mL溶解,合并兩液混勻,用4󰀁0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到5󰀁5,加水酶活力(U/g)=式中:W3#對(duì)照品溶液每1mL中含酪氨酸的量,單位為微克(󰀁g);W#供試

15、品的取樣量,單位為毫克(mg);10#反應(yīng)時(shí)間;11#測定總體積;n#供試品的稀釋倍數(shù);1000#毫克與克的轉(zhuǎn)換倍數(shù)。在上述條件下,每分鐘水解酪蛋白生成1󰀁g酪氨酸所需的嫩肉粉的量為1個(gè)酶活力單位。215󰀁中國食品添加劑分析測試ChinaFoodAdditives2󰀁結(jié)果與討論2󰀁1󰀁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用100󰀁g/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,在275󰀁0nm處進(jìn)行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1,以0󰀁1mol/L鹽酸溶液為空白。其回歸方程y=0󰀁

16、0075x-0󰀁0019,相關(guān)系數(shù)r=0󰀁9996。在酪氨酸濃度為0100󰀁g/mL范圍內(nèi),酪氨酸濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。2󰀁4󰀁樣品的檢測與分析分別取市售不同嫩肉粉,按上述方法處理,測定其酶活力,結(jié)果見表3。表3󰀁樣品測試分析結(jié)果Tab󰀁3󰀁Resultsofanalysissample樣品名稱嫩肉粉1嫩肉粉2嫩肉粉3嫩肉粉4酶活力(U/g)51645226965192370015981630平均酶活力(U/g)5195944401614結(jié)果表明,市售各種嫩

17、肉粉中木瓜蛋白酶活力參差不齊,則木瓜蛋白酶對(duì)肉類的蛋白分解能圖1󰀁酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig󰀁1󰀁ThestandardcurveofTyrosine力也有較大差異,最終將影響到嫩肉粉的嫩化作用。其中,嫩肉粉2酶活力最高,其每次使用添加量少且肉類浸泡時(shí)間短(見該產(chǎn)品的外包裝說明);嫩肉粉1酶活力適中,其每次使用添加量比嫩肉粉2略多且肉類浸泡時(shí)間也略長(見該產(chǎn)品的外包裝說明);嫩肉粉4酶活力較低,其每次使用對(duì)肉類需浸泡較長時(shí)間(見該產(chǎn)品的外包裝說明)。嫩肉粉3酶活力為0,可能該產(chǎn)品里面的木瓜蛋白酶已失去活力,或者該產(chǎn)品根本就沒有添加木瓜蛋白酶,屬于偽劣商

18、品?？梢?嫩肉粉酶活力的大小直接反映了該產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)劣。2󰀁2󰀁精密度取市售嫩肉粉樣品1,做6個(gè)平行樣,由表1可知,酶活力相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2󰀁6%。表1󰀁精密度實(shí)驗(yàn)Tab󰀁1󰀁Theresultsoftheprecisiontest測量次數(shù)123456酶活力94879366893889729448930592532392󰀁6平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)3󰀁結(jié)論利用紫外分光光度法能準(zhǔn)確地測定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力,該法樣品處理簡便,所需儀器簡單,步驟簡明,能快速、直觀地測出嫩肉粉中木瓜蛋白酶分解肉類蛋白能力的強(qiáng)弱,為判斷嫩肉粉產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣提供重要參考。參考文獻(xiàn):1張春紅.食品酶制劑及應(yīng)用M.