基于圖像分析的DNA定量分析研究

1、基于圖像分析的DNA定量分析研究            基于圖像分析的DNA定量分析研究    2008-6-3 12:37:34                          

2、;                       【關鍵詞】  DNA摘要：目的運用ICM（Image Cytometer）對圖像進行處理和分析，在給出細胞形態(tài)學參數的同時對DNA的含量進行定量分析，能有效地協助醫(yī)生對諸如腫瘤等多種病癥做出診斷。方法以        基于圖像分析的DNA定量

3、分析研究    2008-6-3 12:37:34                                          

4、60;      1  材料與方法1.1  材料宮頸脫落細胞樣本取自湖北省武漢市腫瘤醫(yī)院、湖北省黃石市第一醫(yī)院和山東淄博計劃生育研究所，保存于50%的乙醇溶液（細胞保存液）中。雞血紅細胞取自健康公雞的動脈血，加入0.3%0.4%的檸檬酸鈉抗凝劑，保存于50%的乙醇溶液（細胞保存液）中。1.2  方法采用液基薄層制片技術，對制作的玻片進行Feulgen染色，再利用全自動DNA細胞圖像定量分析儀完成對細胞圖像的采集、處理和DNA定量分析。1.2.1  液基薄層制片 在細胞保存液中加入0.1%DTT消化液放在振

5、蕩器上振蕩2 h,然后將消化后的細胞懸液離心5 min(800 r/min)，棄上清液后加入50%乙醇分別清洗、離心2次(800 r/min×5 min/次)。然后將用保存液稀釋的細胞混懸液放入細胞涂片離心機甩片5 min,制成薄層細胞學玻片14 。1.2.2  Feulgen染色  固定液：10%緩沖福爾馬林液（pH 7 .4）；酸解液：鹽酸，濃度5mol/L；酸解溫度：25(與武漢四五月份室內溫度基本接近)；酸解時間： 45 min；測量濾色鏡波長：560 nm。染色過程： 涂片空氣干燥1 h，固定液固定1 h；蒸餾水漂洗10 min；5 mol/L HCl，

6、25酸解45 min，(溫控水浴)；蒸餾水漂洗5 min；與Schiff染液反應45 min (25)；蒸餾水漂洗5 min；自來水沖洗15 min (穩(wěn)水)，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封固15，16  。1.2.3  DNA定量分析 全自動DNA細胞圖像定量分析儀的系統(tǒng)構成及分析流程  ：武漢大學光譜與成像儀器工程技術研究中心自主開發(fā)的全自動DNA細胞圖像定量分析儀硬件系統(tǒng)由Olympus BX41顯微鏡、恒流源、自動上下片系統(tǒng)、精確位移三維平臺(包括載物臺、步進電機、三軸原點定位傳感器、條碼掃描器等)、CCD攝像機、操縱桿、控制器和、計算機等組成（見圖1）

7、。軟件系統(tǒng)自動聚焦、掃描、圖像采集程序(盧國強. ICM分析自動化及應用研究.武漢大學碩士學位論文)，細胞圖像數據庫、細胞特征庫、知識模型庫和智能分析處理程序(張燕. 遺傳算法和支持向量機在DNA細胞圖像分析儀中的應用.武漢大學碩士學位論文)，六大功能模塊構成。分析流程如圖2所示。圖1  全自動DNA細胞圖像定量分析儀硬件構成 （略）圖2  DNA定量分析的流程（略）扣背底算法 ：為了克服光學傳遞中的不均勻性，我們采集了一幅空視野作為亮場背底圖像，然后在后面采集的細胞圖像中除去這個背底圖像，用這種方法可以有效地減少視場不勻帶來的誤差。全局扣背底為測量細胞圖像分析儀的光均勻度

8、，在玻片上尋找一個空白位置（染色后的背底，一般還會有少量的雜質）采集一幅背底圖像，背底圖像的灰度分布不均勻（見圖3），其灰度直方圖也不是規(guī)則的單峰，這是與顯微鏡的光路系統(tǒng)直接相關的，如果不采用軟件系統(tǒng)進行校正，會帶來極大的測量誤差。均勻度指背景光強的灰度標準差和變異系數（coefficient of variation）。它們描述了背景光的均勻性，要求背景圖像的像素點灰度變異系數小于3%。其公式如下：sd=1     MNM     i=1N     j=1fij(x,y)-

9、     f(x,y)21/2         （1）CV=sd          f(x,y)    其中sd為圖像各個像素灰度的標準差，fij(，y) 為某一個像素點的灰度值（0255），     f(x,y)為圖像所有像素灰度的平均值， M，N分別是圖像的長和寬。 cv為圖像各個像素灰度的變異系數。圖3  采集的

10、背底圖像 （略）     圖4  背底圖像分割效果圖 （略）   圖5  變異系數（略）由圖4可見，由于背底圖像的灰度分布不均勻，二值化后的圖像存在不規(guī)則邊緣（圖中藍色表示背景中灰度值較小的區(qū)域）。圖5中，其直方圖的第1個峰為某處視場進行扣背底后計算的像素點灰度值變異系數（1.08%），第2個峰為未扣背底計算的變異系數（3.82%），第3個峰為標準規(guī)定的變異系數最大值（3%）?？鄢植勘车椎姆椒ㄅc全局扣背底類似。一般是將細胞的外接矩形擴展2個像素，然后在此范圍內計算除了細胞的有效像素之外的所有背景像素的灰度平均值，

11、并以此平均值作為平均背底在細胞的每個有效像素中扣除。扣除算法可以用相除或相減（本DNAICM程序中用相除）。由于雞血紅細胞比宮頸脫落細胞小得多，且有的細胞連接較緊密，采用將細胞的外接矩形擴展2個像素的方法會使外擴區(qū)域中包含其他雞血紅細胞的有效像素，從而在計算積分光密度時產生誤差，所以采用外擴1個像素的方法。    3 4               基于圖像分析的DNA定量分析研究   

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13、#160;  2  結果2.1  冷酸法Feulgen染色后的效果    20倍鏡下經45 min酸解的雞血紅細胞在全自動DNA細胞圖像定量分析儀中采集的圖像如圖68所示。由圖可見，細胞邊緣清晰，著色均勻，效果優(yōu)于熱酸法。圖6  原始細胞圖像（略）              圖7  背底圖像（cv=1.62%）（略）      

14、        圖8  全局扣背底后的圖像（略）2.2  20倍鏡下雞血紅細胞積分光密度直方圖的比較    20倍鏡下經45 min酸解的雞血紅細胞（十個視場，共1500個細胞）分別按照下面四種不同的方法進行實驗，并比較實驗結果（見圖9）。結果見表1。由表1可以得出：IOD離散程度全局扣背底加局部扣背底時最小。理想的玻片背底是均勻的，但實際上由于經Feulgen染色后玻片上殘留染色物質的分布不均和照明光源的不均勻性，使得玻片背底實際的灰度分布不均勻。如果不扣除這種不均勻性，在

15、玻片不同位置或者是視場的不同位置測得的相同細胞核的灰度值不同，計算出的IOD值也會受影響。而全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。再進行一次局部扣被底，把背景不均勻性的影響再次減小，所以此時得到的IOD的主峰緊密程度最好，離散程度最?。籌OD方差各不相同，其中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要小。這也是由于全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。表1  4種扣背底方法的比較（略）圖9  （略）（1）全局扣背底、局部扣背底后的細胞IOD直方圖；（2）全局不扣背底、局部扣背底后細胞IOD直方圖；（3）全局扣背底、局部扣背底后的細胞IOD直方圖；（4）全局不扣

16、底、局部不扣背底后的細胞IOD直方圖。坐標系中橫坐標表示IOD值，縱坐標表示細胞個數2.3  宮頸脫落細胞DI（DNA Index,DNA指數）直方圖、散點圖  20倍鏡下的正常人體宮頸細胞和發(fā)生癌變的人體宮頸細胞（全局扣背底、局部扣背底）DI直方圖、散點圖的比較（見圖10）。圖10 （略） （1）、（2）正常人體宮頸細胞直方圖和散點圖；（3）、（4）發(fā)生癌變的人體宮頸細胞直方圖和散點圖直方圖中橫坐標表示DI值，縱坐標表示細胞個數；散點圖中橫坐標表示DI值，縱坐標表示細胞核面積由于宮頸脫落細胞比雞血紅細胞大得多且DNA含量較穩(wěn)定，所以正常人體細胞IOD直方圖中IOD值的離散

17、程度更小（約90%的細胞在主峰的正負10%范圍內），DI值的主峰更細，系統(tǒng)測量的結果更精確。由于發(fā)生癌變的細胞中DNA含量增加，DI值大于2的細胞個數明顯增多，醫(yī)生可以根據DI值來判斷細胞的癌變程度并作出診斷。    3 4               基于圖像分析的DNA定量分析研究    2008-6-3 12:37:34    &#

18、160;                                            3  結論細胞DNA定量分析對從硬件平臺到軟件算法都有著極為嚴格

19、的要求，以保證定量分析的精度和診斷結果精確性。DNA定量分析的關鍵是對細胞的積分光密度和形態(tài)學參數（面積、形狀因子等）的準確測量。其中第一步就是要獲取準確、清晰的圖像，這就對細胞制片和染色環(huán)節(jié)提出了嚴格的要求。液基薄層制片技術的運用，Feulgen染色中冷酸法的選擇保證了所制玻片完全滿足DNA定量分析的需要。在細胞積分光密度和形態(tài)學參數測量之前對細胞圖像進行扣背底處理，很好的消除了顯微鏡光路系統(tǒng)帶來的測量誤差，克服了光學傳遞中的不均勻性，使得細胞積分光密度的測定更加精確。參考文獻：  徐元. ICM技術研究進展及其應用前景J.實用腫瘤雜志，1999 ，14（1）：3.  張

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