土壤中解磷細(xì)菌的分離與純化

1、土壤中解磷細(xì)菌的分離與純化（李其帥、林志軍、王棟棟、周宏、孟海青、紀(jì)凱華）生科05級2班摘要：磷細(xì)菌是存在于自然界，主要是土壤中的一類溶解(dissolve)磷酸化合物(phosphate compound)能力較強(qiáng)的細(xì)菌的總稱。通過磷細(xì)菌的作用，可使土壤中不能被植物利用的磷化物轉(zhuǎn)變成可被利用的可溶性磷化物。故又稱溶磷細(xì)菌。主要有兩類，一類稱為有機(jī)磷細(xì)菌，主要作用是分解有機(jī)磷化物如核酸、磷脂等；另一類稱為無機(jī)磷細(xì)菌，主要作用是分解無機(jī)磷化物，如磷酸鈣、磷灰石等。磷細(xì)菌主要是通過產(chǎn)生各種酶類或酸類而發(fā)揮作用的?？捎盟瞥杉?xì)菌肥料，實(shí)踐證明，對小麥、甘薯、大豆、水稻等多種農(nóng)作物，以及蘋果、桃等果樹

2、具有一定增產(chǎn)效果。農(nóng)業(yè)上常用的菌有解磷巨大芽孢桿菌（Bacillusmegatherium varphosphaticum），俗稱為“大芽孢”磷細(xì)菌，此外，還有其他芽孢桿菌和無色桿菌（Achromobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）等。我們此次試驗(yàn)?zāi)康氖菑耐寥乐蟹蛛x出無機(jī)解磷細(xì)菌，觀察解磷細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行生理生化鑒定，進(jìn)一步熟悉掌握微生物實(shí)驗(yàn)的基本技能。關(guān)鍵詞：土壤 解磷細(xì)菌 無機(jī)磷細(xì)菌 含磷培養(yǎng)基 分離提純 生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1）掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。2）學(xué)習(xí)并掌握分離純化無機(jī)解磷細(xì)菌的基本方法。 3）鞏固和貫通所學(xué)的無菌技術(shù)、純

3、培養(yǎng)技術(shù)、保藏技術(shù)、顯微技術(shù)、等微生物操作技術(shù)。4）學(xué)習(xí)通過微生物的形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)來鑒別解磷細(xì)菌與其他微生物的異同。試驗(yàn)原理1） 菌種來源：由于各種微生物對營養(yǎng)物質(zhì)需求不同，在不同地方采樣對選取所要的微生物含量和其它雜菌含量的多少直接有關(guān)。所以要選擇無機(jī)磷含量較高的土壤中采樣。2） 培養(yǎng)基的選?。簽榱耸顾臒o機(jī)解磷細(xì)菌能生長，其它微生物生長受到一定的抑制，要用選擇培養(yǎng)基。還要把解磷菌與其他微生物相區(qū)別，還要用鑒別培養(yǎng)基。為了達(dá)到即是選擇培養(yǎng)基又是鑒別培養(yǎng)基，選取以磷酸鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基。這樣又能起到選擇培養(yǎng)的目的，又能通過有無解磷圈鑒別無機(jī)解磷細(xì)菌。3）培養(yǎng)及分離純化：通過涂布培養(yǎng)

4、法、平板劃線法等方法達(dá)到分離純化的目的。4）保藏：通過分離純化得到的菌種，接種與斜面培養(yǎng)基上，到一定時間后進(jìn)行傳代培養(yǎng)保藏，使其不死亡、減少突變所引起的生物學(xué)性狀的改變。5）通過形態(tài)與染色鑒定：由于各種微生物有其特定的菌落形態(tài)特征和單細(xì)胞形態(tài)特征，可通過這些形態(tài)進(jìn)行鑒定。還由于細(xì)胞壁組成不同可進(jìn)行鑒別染色法進(jìn)行鑒定，也可用產(chǎn)生不產(chǎn)生芽孢進(jìn)行芽孢染色。通過以上方法可對所分離純化的菌種進(jìn)行初步的鑒定。6）通過生理生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定：各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異，如表現(xiàn)在對對大分子糖類和蛋白質(zhì)的分解能力，以及分解代謝的最終產(chǎn)物的不同，反映出他們有不同的酶系。我們在實(shí)驗(yàn)室允許的條件下做了糖類發(fā)

5、酵與氧化、是否能產(chǎn)生過氧化氫酶以及是否含有細(xì)胞色素氧化酶等生理生化試驗(yàn)，進(jìn)行再次鑒定。 用品器材：潔凈試管 培養(yǎng)皿500ml和250ml錐形瓶各一個，玻璃珠 高壓鍋 10ml和100ml量筒 1ml移液槍配槍頭 牛皮紙 玻璃涂棒 接種環(huán)顯微鏡 酒精燈 載波片 蓋玻片 擦凈紙 雙層瓶（香波油 二甲苯） 試管架 等無菌水 堿性美蘭 石炭酸復(fù)紅染色液 結(jié)晶紫 碘液 乙醇 番紅 5%孔雀綠水溶液 1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液。1%-萘酚乙醇溶液。3%過氧化氫水溶液等 無機(jī)磷培養(yǎng)基 葡萄糖 5.0克 硫酸銨 0.25克 NaCl 0.15克KCl 0.15克 7水硫酸鎂 0.15克 磷酸鈣 2.5克 4水

6、硫酸錳 0.015克 7水硫酸亞鐵 0.015克 瓊脂 8克 蒸餾水 500ml PH 7.0到7.2 糖酵解培養(yǎng)基 蛋白胨0.2%, 磷酸二氫鉀0.03% 氯化鈉0.5% 糖1% 瓊脂 0.50.7% 溴百里酚0.003%。 PH 7.07.4分離純化1 配置培養(yǎng)基和滅菌根據(jù)上述培養(yǎng)基成分，到藥品室找到相應(yīng)材料，用天平稱量，加到500ml錐形瓶中，玻璃棒攪拌均勻（必要時加熱），塞上棉塞，雙層牛皮紙?jiān)每?；試管塞上棉塞，用牛皮?個扎一捆；平皿6個一包，牛皮紙?jiān)茫瑢⑺鼈兺埔簶?、玻璃珠、玻璃涂棒、量筒?00ml圖錐形瓶放入高壓鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌 ：121攝氏度下 20分鐘。待用。2 在點(diǎn)燃

7、的酒精燈附近將培養(yǎng)基倒入平皿，冷卻制成9個平板，待用3 取樣并制備土壤稀釋液 找一處含沙質(zhì)較多的土壤，靠近植物根部取其表層5cm以下的土適量于塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。稱出10克于帶有無菌玻璃珠的250ml錐形瓶中，用已滅菌的量筒量取90ml無菌水溶解，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混勻。點(diǎn)燃酒精燈在火焰附近，用無菌移液槍從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml 無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌移液槍從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀釋度的土壤溶液4 涂布。將上述 9個平板分別貼上標(biāo)簽10-

8、4、10-5、10-6各三個，然后用無菌移液槍分別由10-4、10-5、10-6 三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml對號放入已寫好稀釋度的平板中 ，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕的涂布均勻，室溫下靜置5到10分鐘，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基5培養(yǎng)。30攝氏度恒溫室中培養(yǎng)3天6 觀察并進(jìn)一步分離純化。 觀察菌落特征，并記錄。再倒兩個平板。點(diǎn)燃的酒精燈附近，從稀釋度合適的培養(yǎng)平板上挑取帶有溶磷圈的菌落，在新制的平板上劃線分離，30攝氏度恒溫室中培養(yǎng)3天7斜面培養(yǎng)放置斜面。挑取單個菌落接種到3個斜面上培養(yǎng)。置于2830恒溫箱中培養(yǎng)h.與此同時，用單菌落進(jìn)行以下鑒定試驗(yàn)簡單染色1.1  涂片

9、 取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴蒸溜水于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作，分別從菌種，菌種斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。1.2固定與干燥將涂片在火焰較高處快速通過幾次，使菌體固定在載玻片上后自然干燥。1.3 染色 將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液12滴。呂氏堿性美藍(lán)于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。染色12min， 。1.4 水洗 傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。1.5 。干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體） 1.5 。 

10、鏡檢 涂片干后鏡檢。采用油鏡觀察革蘭氏染色  1.1 涂片 常規(guī)涂片法 1.2 初染 滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于涂片上，染色12min ，傾去染色液，細(xì)水沖洗至洗出液為無色。 1.3媒染 用碘液媒染約l min ，水洗。 1.4  脫色     用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，終止脫色，干燥。   1.5  復(fù)染 在涂片上滴加番紅液復(fù)染約

11、23min ，水洗，然后用吸水紙吸干。1.6 鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。1.7 清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。芽孢染色1）將培養(yǎng)的菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計(jì)算約45分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約

12、76）染10分鐘。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，理化試驗(yàn)一H2O2酶實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)方法挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)置于兩片干凈的玻片上，滴加3%過氧化氫溶液2mL于菌種上，觀察結(jié)果，若半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。二糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來斷定。在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溴甲酚紫Ph5.2(黃色)6.8（紫色），當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明1.配培養(yǎng)基：滅菌 110°C 20分鐘 甘油采用121°C 20分

13、鐘滅菌。2、編號，寫標(biāo)簽。接種3、將上述以接種的淀粉，葡萄糖、蔗糖，密封于未密封的試管和對照管置于37溫室中培養(yǎng)24小時。三 細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)試劑1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液。1%-萘酚乙醇溶液。試驗(yàn)方法取37(或低于37)培養(yǎng)20h的斜面培養(yǎng)物一支，將兩種試劑各23滴，從斜面上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經(jīng)斜面上的培養(yǎng)物。如系平板培養(yǎng)物，則可用試劑混合液滴在菌落上。于2min內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為陽性。陽性培養(yǎng)物大多數(shù)于半分鐘內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反應(yīng)均作為陰性結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）菌落特征；實(shí)驗(yàn)取10-4、10-5、10-6稀釋度。其中菌落數(shù)分別為165、53、1

14、2個。最后一個稀釋度只有一個培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)透明圈，其他培養(yǎng)基均發(fā)現(xiàn)有透明圈。其中有兩種菌落有明顯透明圈,特征為：1、 菌株一（暫命名為JP1）：菌落大?。?3mm，形狀：圓形，表面：光滑，有光澤、邊緣整齊、半透明，顏色：淡黃色，低凸面。2、 菌株二（暫命名為JP2）：菌落大小：1mm，形狀：圓形，表面：光滑，有光澤、邊緣整齊、不透明，顏色：白色，凸面。選擇其中JP1做為研究菌株（二）鏡檢結(jié)果：1、革蘭氏染色：陽性。菌株一2、芽孢染色：有芽孢、形狀為卵圓形。3、菌形：桿狀。（三）生理生化特征：實(shí)驗(yàn)類型糖酵解H2O2 酶分解細(xì)胞色素C結(jié)果產(chǎn)酸不產(chǎn)氣陽性結(jié)果分析： 先有鏡檢結(jié)果得知該菌為革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢

15、桿菌，由此查伯杰氏手冊的第十五部分：芽孢桿菌和球菌的芽孢桿菌科芽孢桿菌屬。確定為臘狀芽孢桿菌屬，拉丁名為：B.cereus。 伯杰氏手冊中的描述為：實(shí)驗(yàn)總結(jié)時間通過實(shí)驗(yàn)，再次熟悉了微生物實(shí)驗(yàn)的有關(guān)操作。并且作為第一次系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)步驟，了解了完成一個實(shí)驗(yàn)的步驟流程，總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)。學(xué)會了使用伯杰氏手冊。能夠根據(jù)目的菌落選擇適當(dāng)?shù)姆椒芭囵B(yǎng)基進(jìn)行篩選，并為下一步實(shí)驗(yàn)保存了菌種?，F(xiàn)對試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)及改進(jìn)方案總結(jié)如下：(一)：經(jīng)驗(yàn)1、大家集體分工協(xié)作的方法及注意事項(xiàng)，利用公共郵箱共享資料。2、實(shí)驗(yàn)時間安排注意微生物生長時間，一般細(xì)菌三到五天即可，不同均根據(jù)情況調(diào)整，使微生物長勢最好（二）：改進(jìn) 1、計(jì)劃要盡量詳細(xì)，避免出現(xiàn)混亂的狀況。 2、培養(yǎng)基現(xiàn)用現(xiàn)倒，培養(yǎng)基存放過長影響培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)：華北農(nóng)學(xué)報(bào) Acta Agriculturae Boreali-Sinica生態(tài)學(xué)雜志 Chinese Journal Of Ecology河南農(nóng)業(yè)科學(xué) Journal Of Henna Agricultural Sciences 現(xiàn)代微生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)作者：林稚蘭，黃秀梨主編微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 致謝詞：本文是在龐昕老師精心指