依達(dá)拉奉在鼠氧自由基心肌損害和人病毒性心肌炎中的抗氧化作用研

1、依達(dá)拉奉在鼠氧自由基心肌損害和人病毒性心肌炎中的抗氧化作用研究        【摘要】     目的 研究依達(dá)拉奉在鼠氧自由基(OFR)心肌損害和人病毒性心肌炎(VMS)中的抗氧化作用。方法 通過檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞培育液的心肌細(xì)胞存活力(CMV)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，肌鈣蛋白T(cTnT)指標(biāo)以對(duì)比依達(dá)拉奉、維生素C和輔酶Q10 對(duì)經(jīng)氧自由基預(yù)處理的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。檢測(cè)治療前后血清SOD，MDA, cTnT指標(biāo)以對(duì)比依達(dá)拉奉、維生素C和輔酶

2、Q10 對(duì)VMS患者的治療作用。結(jié)果 (1)大鼠實(shí)驗(yàn)示：依達(dá)拉奉組CMV高于維生素C組(P<0.05)和輔酶Q10 組(P<0.05),SOD活性高于維生素C(P<0.05);MDA低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05); cTnT低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05)。(2)VMS研究示：經(jīng)治療，依達(dá)拉奉組患者SOD活性上升高于維生素C組及輔酶Q10 組(均為P<0.05); MDA和cTnT下降高于維生素C組及輔酶Q10 組( MDA均為P<0.01，cTnT均為P<0.05)。結(jié)論

3、 依達(dá)拉奉在鼠OFR心肌損害和VMS的抗氧化治療中有明顯效果。     【關(guān)鍵詞】  依達(dá)拉奉;氧自由基;病毒性心肌炎    The Anti-oxygen Effect of Edaravone on the Injured Myocardial Cells of Rats by Oxygen Free Radicalsand on Those of Patients with Viral MyocarditisDai Min, Liu Jing, Wu Yi, the Heart Center, th

4、e Central Hospital of Mianyang City, Sichuan Province 621000, P.R.ChinaABSTRACT Objective To study the anti-oxygen effect of edaravone on the injured myocardial cells of rats by oxygen free radicals (OFR) and on those of patients with viral myocarditis. Methods The detected index of cardiomyocytes v

5、iability (CMV), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and troponin T (cTnT) of the injuried myocardial cells of rats by OFR were applied in the comparative observation of the protective effect of edaravone, Vitamin C and coenzyme Q10 on the myocardial cells pre-prepared by OFR; the index

6、 of SOD, MDA and cTnT in serum detected before and after treatment were applied in the comparative observation of the therapeutic effect of edaravone, Vitamin C and coenzyme Q10 on patients with viral myocarditis (VMS). Results (1) The experiment on rats showed out: the CMV in edaravone group was hi

7、gher than that in Vitamin C group (P<0.05) and that in coenzyme Q10 group (P<0.05); the SOD activity in edaravone was higher than that in Vitamin group (P<0.05); the MDA and cTnT in edaravone group were lower than those in Vitamin C group (P<0.05) and those in coenzyme Q10 group (P<0.

8、05). (2) The observation of the patients with VMS showed out: the SOD activity of the patients in edaravone group rose higher than that in Vitamin C group (P<0.05) and that in coenzyme Q10 group (P<0.05); the decrease of MDA and cTnT in edaravone group was more significant that that in Vitamin

9、 C group (P<0.01) and that in coenzyme Q10 group (P<0.05). Conclusions Edaravone is of obvious effect on the injuried myocardial cells of rats and in anti-oxygen treatment of the patients with VMS.KEYWORDS edaravone oxygen free radicals viral myocarditis國內(nèi)外多項(xiàng)研究已證實(shí)氧自由基(oxygen free radicals OFR)

10、對(duì)心血管系統(tǒng)的損害1-2,OFR參與了心肌炎、心力衰竭、克山病和冠心病等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程3，尤其在病毒性心肌炎(VMS)的過氧化損害中起重要作用。目前VMS的抗氧化治療主要是大劑量維生素C4,但劑量過大可使血液酸度升高，對(duì)心肌亦有損害。其他抗氧化劑如輔酶Q10存在難溶解，易沉淀，質(zhì)量不穩(wěn)定等工藝問題。依達(dá)拉奉(Edaravon 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是一種新型氧自由基清除劑5，該藥能高效清除病變部位氧自由基，在腦缺血再灌注損傷的治療中有一定療效，因此用于VMS的抗氧化治療應(yīng)具有很大潛力。本研究旨在觀察依達(dá)拉奉對(duì)氧自由基所致大鼠心肌損害的保護(hù)作用和對(duì)人VMS的治療作

11、用，探討其機(jī)制，為臨床尋找VMS抗氧化治療的可行方法提供參考。1 材料與方法1.1 研究對(duì)象和材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：wistar大鼠乳鼠10只，購于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心，平均體重(250±20)g(合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管第70號(hào))。(2)臨床患者：2007年5月2009年6月間就診于我院滿足：發(fā)病1周內(nèi)，肌鈣蛋白T(cTnT)陽性，特異型柯薩奇B組病毒(CVB)IgM陽性，符合1999年全國心肌炎心肌病專題研討會(huì)提出的成人急性心肌炎診斷參考標(biāo)準(zhǔn)的患者30名，平均(18.71±5.62)歲。(3)材料：小牛血清由成都華西生物研究所提供;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶由GIBCO公司(美

12、國)提供;依達(dá)拉奉注射液(10mg/5ml)由先聲藥業(yè)提供(國藥準(zhǔn)字H20031342);輔酶Q10注射液(5mg/250ml)由西南藥業(yè)提供(國藥準(zhǔn)字H10061135);丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)實(shí)劑盒均購于南京建成生物工程研究所。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.2.1.1 模型制作及指標(biāo)測(cè)定 參考文獻(xiàn)6方法在四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大鼠模型制作：wistar大鼠無菌條件下開胸取心，剪碎，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，用含胎牛血清、青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基制成心肌細(xì)胞懸液。接種于六孔

13、板，密閉靜置37培養(yǎng)，第3天供實(shí)驗(yàn)用。用Mossman法測(cè)定心肌細(xì)胞存活力(CMV);肌鈣蛋白T(cTnT)測(cè)試儀測(cè)算cTnT濃度;硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)算MDA活性;黃嘌呤氧化酶法測(cè)算SOD活力。1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)分組及指標(biāo)測(cè)算 大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：第組：對(duì)照組;第組：(H2O2組)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入200mol/L H2O2;第組：(H2O2 加維生素C組)培養(yǎng)液中加入200mol/L H2O2 和50mg/L維生素C;第組：(H2O2 加輔酶Q10組)培養(yǎng)液中加入200mol/L H2O2 和5mg/L輔酶Q10注射液;第組：(H2O2 加依達(dá)拉奉組)培養(yǎng)液中加入200mo

14、l/L H2O2 和30mg/L依達(dá)拉奉注射液。于20min后測(cè)算各組CMV，SOD活力，MDA，cTnT指標(biāo)。1.2.2 臨床研究1.2.2.1 藥物干預(yù)及實(shí)驗(yàn)分組 本研究程序符合人體實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均需簽署知情同意書。入院后診斷為VMS的患者按計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的隨機(jī)序號(hào)分為維生素C組、輔酶Q10組及依達(dá)拉奉組，均常規(guī)給予臥床休息，利巴韋林抗病毒感染及對(duì)癥治療。維生素C組(第組)給予靜脈維生素C 500mg/d;輔酶Q10組(第組)給予靜脈輔酶Q10 5mg/d;依達(dá)拉奉組(第組)給予靜脈依達(dá)拉奉50mg/d治療;療程7天。1.2.2.2 監(jiān)測(cè)指標(biāo) 所有患者治療前檢測(cè)血清SOD，MDA, c

15、TnT，治療7天后復(fù)查SOD，MDA, cTnT，并測(cè)算各指標(biāo)治療前后差值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)三組患者平均年齡、性別比(男/女)、入院cTnT值和CVBIgM滴度等基本情況進(jìn)行比較。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)”表示，應(yīng)用SPSSl5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。2 結(jié) 果大鼠心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)示(表1):(1)H2O2組心肌細(xì)胞CMV低于對(duì)照組(P<0.01)，維生素C、輔酶Q10及依達(dá)拉奉組CMV高于H2O2組(各組均為P<0.01)，但均低于對(duì)照組(各組均為P<0.01)。依達(dá)拉奉

16、組CMV高于維生素C組(P<0.05)和輔酶Q10 組(P<0.05)。(2)H2O2組 SOD活性低于對(duì)照組(P<0.01);MDA和cTnT均高于對(duì)照組(P<0.01)。維生素C、輔酶Q10及依達(dá)拉奉組SOD活性均高于H2O2組(各組均為P<0.01);MDA和 cTnT均低于H2O2組(各組均為P<0.01)。依達(dá)拉奉組SOD活性高于維生素C(P<0.05);MDA低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05); cTnT低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05)。VMS患者抗氧化治療實(shí)

17、驗(yàn)示(表2)：依達(dá)拉奉組SOD活性上升高于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05);MDA下降高于維生素C組(P<0.01)及輔酶Q10 組(P<0.01);cTnT下降高于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組患者間平均年齡、性別比(男/女)、cTnT值和CVBIgM滴度均為P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表1 各組大鼠心肌細(xì)胞生化指標(biāo)比較表2 各組VMS患者生化指標(biāo)差值(治療前后差值的絕對(duì)值)比較注：*與、組比較P<0.01, 與、組比較P<0.053 討 論正常心肌代謝可產(chǎn)生H2O

18、2、·O-2、·OH等高活性物質(zhì)，即所謂OFR。OFR可作用于生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用和巰基氧化作用，損傷細(xì)胞膜，使大量細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷，引起細(xì)胞致死性損傷。在正常情況下體內(nèi)存在清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的酶系統(tǒng)，如SOD、GSH-PX(谷胱甘肽過氧化物酶)等，使機(jī)體維持自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，防止自由基損傷。當(dāng)機(jī)體感染病毒或細(xì)菌時(shí)，中性粒細(xì)胞在吞噬微生物時(shí)耗能增加，產(chǎn)生大量OFR，同時(shí)免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的抗體復(fù)合物、補(bǔ)體等可促進(jìn)吞噬細(xì)胞產(chǎn)生OFR,從而引起心肌過氧化損傷7。故應(yīng)用抗氧化劑清除OF

19、R以治療急性VMS有一定的療效。近年臨床治療VMS的抗氧化劑主要包括維生素C、黃芪及其提取物8-9和輔酶Q10 10等,而研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑除抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑11外，尚能有效清除羥自由基(·OH)12，故具有比傳統(tǒng)抗氧化劑更強(qiáng)的抑制過氧化損傷作用。本實(shí)驗(yàn)以維生素C和輔酶Q10 作為對(duì)比劑，選擇機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA反映過氧化程度、SOD活性反映機(jī)體清除OFR的能力、 cTnT反映心肌細(xì)胞損傷程度，研究新型抗氧化劑依達(dá)拉奉對(duì)VMS的治療作用。結(jié)果顯示依達(dá)拉奉對(duì)氧自由基所致大鼠心肌損害的恢復(fù)CMV和SOD活性，減少M(fèi)DA和cTnT升高的療效優(yōu)于維生

20、素C及輔酶Q10;對(duì)VMS患者恢復(fù)SOD活性、降低MDA和cTnT的療效優(yōu)于維生素C及輔酶Q10 。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)兩方面證實(shí)依達(dá)拉奉的抗氧化能力優(yōu)于傳統(tǒng)抗氧化劑，從而為臨床治療心肌炎開拓了新的治療理論和方法，為依達(dá)拉奉在臨床的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。我們的研究尚存在一定局限性，如樣本數(shù)量較小，不能完全除外入選患者混雜因素的影響。確切結(jié)論仍需大樣本多中心研究進(jìn)一步明確。    【參考文獻(xiàn)】  1 葛 明,王立琴,沈德煒,等. 小兒病毒性心肌炎的氧自由基變化及其相關(guān)因素J.山東醫(yī)藥,2000,40(10):69-70.2 趙蓮華,燕 秋.過氧化脂

21、質(zhì)和超氧化物歧化酶與病毒性心肌炎急性期檢測(cè)的意義J.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,24(2):106.3 翟艷紅,康素玲.氧自由基與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系J.醫(yī)學(xué)綜述, 2001,7(5):280-282.4 季新義,季 蓓. 病毒性心肌炎的治療近況J.醫(yī)學(xué)綜述,2003,9(5):293-295.5 Edaravone Acute Infarction Study Group. Effect of a novel free radical scavenger, edaravone(MCI-186),on acute brain infarction. Randomized, lacebo-controlled, double-blind study at multicentersJ. Cerebrovascular Disease, 2003,15(3):222-229.6 王 娜，關(guān) 鵬，段相林，等.新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)J.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，31(2)：256-259，263.7 彭健毫,張連峰.病