側(cè)柏葉總黃酮的純化工藝研究

1、陳興芬, 單承鶯, 姜洪芳, 等. 側(cè)柏葉總黃酮的純化工藝研究J.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(3:400-402.側(cè)柏葉總黃酮的純化工藝研究陳興芬1, 2, 單承鶯2, 姜洪芳2, 張衛(wèi)明1, 2(1. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京210097; 2. 南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇南京210042摘要:從6種不同型號(hào)的大孔樹脂中篩選出最佳大孔樹脂進(jìn)行純化試驗(yàn), 分析比較靜態(tài)吸附和解吸情況, 考察側(cè)柏葉總黃酮的純化工藝, 最終選取AB-8大孔樹脂并確定其最佳吸附條件為:樣品溶液中總黃酮含量在1. 4m g /mL左右, 在p H 值為4. 5、25 下恒溫振蕩8h ; 最佳解

2、吸條件為:用80%乙醇洗脫, 解吸液用量為10mL /g。獲得的總黃酮純度達(dá)到47. 941%。關(guān)鍵詞:側(cè)柏葉; 總黃酮; 靜態(tài)吸附; 靜態(tài)解吸中圖分類號(hào):R 284. 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002-1302(2011 03-0400-03(上接第399頁(yè)比較甜瓜未去蛋白粗多糖和去蛋白多糖紅外光譜圖, 可以看到在625. 32c m -1處峰明顯不同, 說明甜瓜多糖中大部 分蛋白質(zhì)已除去。3 結(jié)論水浸提輔以超聲波處理提取甜瓜多糖的最佳工條件是:超聲波處理時(shí)間為45m i n 、反應(yīng)溫度為70 、總浸提時(shí)間為3h 、液料比為25 1, 提取甜瓜多糖的含量為3. 78%。參考文獻(xiàn):1向東

3、山. 苯酚-硫酸比色法測(cè)定竹節(jié)參水溶多糖的含量J.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(4:279-280.2張紅巖, 品 林. 鹿茸酸性多糖的含量測(cè)定研究J.中成藥,1998(10:34-36.3鄧澤元, 劉 娟, 余迎利. 決明子水溶性多糖提取的研究J.食品科學(xué), 2002, 23(1:72-75.4羅登宏. 超聲波輔助提取金針菇多糖工藝參數(shù)優(yōu)化研究J.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(2:316-317.5田庚元, 馮宇澄. 植物多糖的研究進(jìn)展J.中國(guó)中藥雜志,1995, 20(7:441-444.6王魯石, 王 莉, 魯建江. 紅景天葉多糖的微波提取及含量測(cè)定J.石河子大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 6(1:18

4、-19.7王自軍, 王國(guó)衛(wèi). 白芥子多糖的微波提取及含量測(cè)定J.海峽藥學(xué), 2005, 17(1:42-44.8馬淑鳳, 陳利梅, 徐化能, 等. 白靈菇胞外多糖的分離純化及其抗氧化活性的研究J.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 26(1:157-162. 9錢 和, 張 添, 劉長(zhǎng)虹. 改良苯酚-硫酸法測(cè)定蘆薈多糖含量J.江蘇食品與發(fā)酵, 2002(2:3-6.10王國(guó)衛(wèi), 趙永亮. 香菇多糖分離最佳工藝及最佳原料探討J.中草藥, 2000, 31(8:584-585.11宋江峰, 李大婧, 劉春泉. 響應(yīng)曲面法優(yōu)選人工蛹蟲草多糖微波提取工藝J.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 25(5:1143-11

5、50. 12鄧國(guó)棟, 郁建平. 正交試驗(yàn)優(yōu)選茶多糖提取工藝J.食品研究, 200, (84-85.側(cè)柏葉別稱柏葉、叢柏葉、扁柏、云片柏等, 是柏科植物側(cè)柏P lat ycladus orientalis (L. Franco的干燥嫩枝葉。中醫(yī)認(rèn)為側(cè)柏葉氣清香, 味苦澀、微辛, 具有涼血止血、祛風(fēng)降濕、化痰止咳、消腫散毒的功效, 明代李時(shí)珍在 本草綱目 中記載為 乃多壽之木 , 所以可以入服食用。大孔樹脂具有大的比表面積和類似活性炭顆粒的內(nèi)細(xì)孔結(jié)構(gòu), 依靠與被吸附分子之間的范德華力從水溶液中有效地吸附有機(jī)化合物, 且具有選擇性吸附有機(jī)化合物的能力, 可用于皂苷、黃酮、蒽醌、生物堿等富集, 其吸附

6、性能、吸附條件參數(shù)因化合物的理化性質(zhì)不同而不同1-3。收稿日期:2010-06-21作者簡(jiǎn)介:陳興芬(1986 , 女, 山東沂源人, 碩士研究生, 主要從事植物生物技術(shù)研究。E -m ai:l sdcxf123126. co m 。通信作者:張衛(wèi)明, 男, 碩士, 研究員, 博士生導(dǎo)師。E -m ai:l botanyz h 163. co m 。1 材料與方法1. 1 材料及藥品側(cè)柏葉購(gòu)于江蘇省南京市先聲藥店, 產(chǎn)于安徽省亳州市, 粉碎過40目篩, 備用; 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品, 由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供, 純度99. 9%; 大孔樹脂包括AB-8樹脂(南開大學(xué)化工廠, NKA -9、HPD45

7、0、H PD400、HPD100、HPD826樹脂(河北省滄州市寶恩吸附材料科技有限公司; 95%乙醇; 石油醚、乙酸乙酯均為分析純, A l C l 3 6H 2O 為化學(xué)純。1. 2 儀器高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司; 電子天平EL-410s(美國(guó)森騰公司; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA (上海亞榮生化儀器廠; 離心沉淀機(jī)LX J- (4000r/mi n , 上海醫(yī)用分析儀器廠; C HA -S 氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇新一佳儀器廠; TU -1800紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀400 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年第39卷第3期器有限責(zé)任公司 。1. 3 方法1. 3. 1 樣

8、品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取適量側(cè)柏葉粉末置于圓底燒瓶中, 65%乙醇提取2次, 每次料液比1g 15mL 、提取時(shí)間2h , 合并提取液, 離心, 取上清液; 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮上清液, 去除乙醇的水溶液, 依次用石油醚和乙酸乙酯萃取, 合并萃取液, 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干粉4。1. 3. 2 黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品, 采用A l C l 3顯色-分光光度法測(cè)定總黃酮的含量5-6。1. 3. 3 大孔樹脂的預(yù)處理 用95%乙醇將樹脂浸泡24h , 使其充分溶脹, 95%乙醇濕法裝柱, 然后用95%乙醇以每小時(shí)2倍樹脂柱體積(bed vol u m e , B V 的流速(2B

9、V /h通過樹脂柱, 至流出液與少量蒸餾水(1 5 混合后至無白色渾濁為止; 再用蒸餾水以同樣流速洗至無醇味; 接著用2BV 的5%HC l 溶液(2B V /h通過樹脂柱, 并浸泡4h , 用蒸餾水以同樣流速洗至流出液的p H 值呈中性; 最后用2BV 的2%N a OH 溶液(2BV /h 通過樹脂柱, 并浸泡4h , 用蒸餾水以同樣流速洗至流出液的p H 值呈中性; 浸泡于蒸餾水中, 備用7。1. 3. 4 大孔樹脂型號(hào)的篩選1. 3. 4. 1 靜態(tài)吸附 稱取乙酸乙酯粉末0. 8g , 用10%乙醇定容至200mL , 離心(3000r/mi n , 10m i n, 上清液即為側(cè)柏葉

10、樣品溶液, 取上清液, 測(cè)定乙酸乙酯總黃酮含量為22. 397%。分別取處理好的6種不同型號(hào)大孔樹脂各2g , 置于50mL 錐形瓶中, 依次加入側(cè)柏葉樣品溶液20mL, 置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩24h(25 , 100r/mi n, 測(cè)定吸附后濾液及樣品溶液中總黃酮含量; 用公式(1 、公式(2 計(jì)算不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)側(cè)柏葉總黃酮的靜態(tài)吸附量與吸附率。 吸附量Q =(C0-C 1 V 1/m (1 吸附率=(1-C 1/C0 100%(2其中, 公式(1 、公式(2 中C 0為樣液中總黃酮初始濃度(mg/mL;C 1為吸附后濾液中總黃酮濃度(mg /mL; V 1為樣液體積(mL; m 為樹

11、脂質(zhì)量(g 。1. 3. 4. 2 靜態(tài)解吸 取靜態(tài)吸附后的樹脂濾干表面水, 加入90%乙醇20mL, 置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩24h (25 , 100r/mi n, 測(cè)定解吸夜中總黃酮含量, 并計(jì)算解吸率。解吸率=(C2 V 2 /(C0-C 1 V 1 100%(3 公式(3 中, C 2為解吸夜中總黃酮濃度(m g/mL;V 2為解吸液體積(mL 。1. 3. 5 AB-8大孔樹脂對(duì)側(cè)柏葉黃酮的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸試驗(yàn)1. 3. 5. 1 樣品溶液中總黃酮含量對(duì)靜態(tài)吸附作用的影響 分別精確稱取0. 05、0. 075、0. 10、0. 125、0. 15g 樣品粉末, 用10%乙醇定容至

12、25mL, 離心(3000r/m i n , 10m i n, 得側(cè)柏葉樣品溶液; 準(zhǔn)確稱取濾干表面水的濕樹脂2g , 置于50mL 錐形瓶中; 分別加入側(cè)柏葉樣品溶液20mL, 置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩24h(25 , 100r/m i n 。測(cè)定吸附液及樣液初始濃度, 并計(jì)算AB-8大孔樹脂對(duì)側(cè)柏葉總黃酮的靜態(tài)吸附量、吸附率。1. 3. 5. 2 樣品溶液的p H 值對(duì)靜態(tài)吸附作用的影響 用1或a 3. 5、4. 5、5. 5、6. 5、7. 5, 并用酸度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)方法從 1. 3. 5. 1 部分的 準(zhǔn)確稱取濾干表面水的濕樹脂2g 開始操作。1. 3. 5. 3 作用時(shí)間對(duì)靜態(tài)吸

13、附作用的影響 在確定質(zhì)量濃度和p H 值的條件下, 每隔一段時(shí)間, 取0. 2mL 吸附液, 測(cè)定吸附后濾液及樣品溶液中總黃酮含量, 計(jì)算AB-8大孔樹脂對(duì)側(cè)柏葉總黃酮的靜態(tài)吸附率。1. 3. 5. 4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靜態(tài)解吸作用的影響 取靜態(tài)吸附后濾干表面水的AB-8大孔樹脂2g , 分別加入不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、70%、80%、90% 的乙醇各20mL , 置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩8h(25 , 100r/min 。對(duì)吸附于樹脂上的總黃酮進(jìn)行解吸, 確定解吸液中總黃酮含量, 并計(jì)算解吸率。1. 3. 5. 5 乙醇用量對(duì)靜態(tài)解吸作用的影響 取靜態(tài)吸附后濾干表面水的AB -8大孔

14、樹脂2g , 分別加入80%乙醇10、20、30、40、50mL, 試驗(yàn)方法從 1. 3. 5. 1 部分的 準(zhǔn)確稱取濾干表面水的濕樹脂2g 開始操作。2 結(jié)果與分析2. 1 大孔樹脂型號(hào)的篩選依據(jù)靜態(tài)吸附率和解吸率選擇樹脂型號(hào), 吸附樹脂利用吸附的可逆性分離植物的有效成分。由于樹脂極性不同, 解吸的難易程度也不同, 故解吸率也是篩選大孔樹脂的又一關(guān)鍵因素。由圖1可知, AB -8、H PD826、H PD100、H PD450、HPD400、NKA -9吸附率變化不大, 但AB -8的解吸率最大, 因此選擇AB-8大孔樹脂分離純化側(cè)柏葉總黃酮。2. 2 AB-8大孔樹脂對(duì)側(cè)柏葉總黃酮的靜態(tài)吸

15、附試驗(yàn)2. 2. 1 樣品溶液中總黃酮含量對(duì)靜態(tài)吸附作用的影響 由圖2可知, 隨著樣品溶液中總黃酮含量增加, 樹脂吸附量亦增大, 當(dāng)樣品溶液中總黃酮含量達(dá)到1. 4625mg /mL 時(shí), 吸附量的變化率較小; 而吸附率隨著樣品溶液中總黃酮含量增加而降低, 為保證吸附率仍在80%以上, 考慮樹脂能否達(dá)到吸附飽和, 故樣品溶液中總黃酮含量在1. 4mg /mL 左右為宜。2. 2. 2 樣品溶液的p H 值對(duì)靜態(tài)吸附作用的影響 由圖3可知, 酸性環(huán)境下的吸附效果優(yōu)于中性及弱堿性環(huán)境。在試驗(yàn)過程中, p H 值越接近堿性, 樣品溶液的顏色越接近棕紅色, 可能與堿性環(huán)境導(dǎo)致側(cè)柏葉中某些黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)

16、發(fā)生改變有關(guān), 3, 4-401 陳興芬等:側(cè)柏葉總黃酮的純化工藝研究 二羥基取代時(shí), 在堿液中不穩(wěn)定, 易被氧化, 故選定樣品溶液的p H 值為4. 5。2. 2. 3 吸附時(shí)間對(duì)靜態(tài)吸附作用的影響 由圖4可知, 在其他條件確定的情況下, 在08h 內(nèi), 隨著吸附時(shí)間增加, 吸附率逐漸增大; 在8h 后吸附變化率較小, 綜合考慮選擇最佳吸附時(shí)間為8h 。2. 2. 4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靜態(tài)解吸的影響 由圖5可知, 乙醇體積分?jǐn)?shù)越高, 解吸效果越好, 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時(shí), 解吸率基本保持不變, 因此選取80%乙醇作為解吸液。2. 2. 5 乙醇用量對(duì)靜態(tài)解吸的影響 由圖6可知, 隨解吸液

17、用量增大, 解吸率升高, 當(dāng)達(dá)到10mL/g 時(shí), 解吸率達(dá)到最大值, 之后增加用量, 解吸率基本不變, 再考慮到溶劑的消耗量, 解吸液最適用量為10mL /g 。3 結(jié)論與討論通過測(cè)定6種大孔樹脂對(duì)側(cè)柏葉總黃酮的吸附、解吸特征, 選取AB-8大孔樹脂并確定最佳吸附條件為:樣品溶液中總黃酮含量在1. 4mg /mL左右, 樣品溶液在p H 值為4. 5、25 下恒溫振蕩8h ; 最佳解吸條件為:用80%乙醇洗脫, 解吸液用量為10mL /g。采用AB-8大孔樹脂按確定的工藝條件純化側(cè)柏葉總黃酮, 收集精制液, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干粉, 經(jīng)樹脂純化后的總黃酮純度達(dá)到47. 941%。參考文獻(xiàn):1劉志祥, 曾超珍. 大孔樹脂法純化苦丁茶總黃酮的研究J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2009, 20(9:2183-2184.2金 瑩, 孫愛東. 大孔樹脂純化蘋果多酚的研究J.食品科學(xué),2007, 28(4:160-163.3盛 萍, 帕麗達(dá) 阿不力孜, 劉 波, 等. 大孔樹脂吸附法富集野菊花總黃酮的工藝研究J.中草藥, 2006, 37