丹酚酸抗氧化活性及其對DNA損傷保護(hù)作用

1、丹酚酸抗氧化活性及其對DNA損傷保護(hù)作用               作者：柳艷，李磊，劉王瑩，陳茂勇，吳倩【關(guān)鍵詞】  丹酚酸；抗氧化；DNA損傷；化學(xué)發(fā)光摘要： 目的  探討丹酚酸抗氧化活性及其對DNA氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法  運(yùn)用自由基反應(yīng)模型觀察丹酚酸對二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)和羥自由基的淬滅效應(yīng)，使用鄰菲羅啉(Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系測定丹酚酸對DNA損傷的抑制作用。高

2、效液相色譜(HPLC）測定丹酚酸的組成。結(jié)果  丹酚酸水提物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附樹脂純化物（RE)和對照維生素(VC)、二丁基羥基甲苯(BHT)對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)分別為1412，153，146，158和715g/ml?；瘜W(xué)發(fā)光體系中，丹酚酸的加入能明顯抑制并延遲DNA損傷。AE、EE、RE抑制發(fā)光50濃度(IC50)值分別為12936，620，492g/ml。丹酚酸清除DPPH自由基能力和對羥自由基攻擊的DNA損傷保護(hù)作用受丹酚酸組成和丹酚酸B含量的影響。結(jié)論  丹酚酸屬于預(yù)防型和斷鏈型抗氧化劑，并可有效清除DPPH和羥自由基，

3、對DNA損傷有明顯保護(hù)作用。丹酚酸的抗氧化活性及對DNA損傷的保護(hù)作用與丹酚酸B含量有關(guān)。關(guān)鍵詞： 丹酚酸；抗氧化；DNA損傷；化學(xué)發(fā)光Antioxidant activiy and protection effect of salvianolic acids on DNA damage  Abstract： Objective  To study on the antioxidant activity of salvianolic acids and mechanisms of its protection against DNA antioxidative damage

4、.Methods  Free radical model was employed to investigate the scavenging activity to 1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) and hydroxyl free radicals.The mechanisms of the effects of salvianolic acids on protection against DNA damage was measured by chemiluminescence on the reaction system of phe

5、nanthroline (Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA.Salvianolic acids composition in samples were determined according to HPLC analysis.Results  The hemi-inhibitable concentration(IC50) of crude aqueous extract(AE)，ethylacetate extract(EE)，resin extract(RE)，ascorbate(VC) and butylated hydroxytoluene(BHT) to D

6、PPH free radicals were 141.2，15.3，14.6，15.8 and 71.5g/ml.Three extracts could obviously inhibit and delay DNA damage caused by hydroxyl free radicals.The IC50 valvue of chemiluminescence of AE，EE and RE were 1293.6，62.0，and 49.2g/ml.The scavenging activity and protective effects against DNA damage w

7、ere effected by salvianolic acids composition and salvianolic acid B level.Conclusion  Salvianic acids can effectively scavenge DPPH and hydroxvl free radicals，protect against DNA damage which belongs to preventive and chain-breaking antioxidants，and the effects are related to salvianolic acid

8、B level.Key words： salvianolic acid；antioxidant；DNA damage；chemiluminescence    丹參是我國防治心腦血管病的傳統(tǒng)藥物，對冠心病、高血壓、糖尿病腎病及癌癥等療效確切。近20多年來的藥效研究表明，丹酚酸是丹參活血化瘀作用的主要功能成分1。自由基參與機(jī)體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，清除自由基、提高機(jī)體抗氧化能力，是許多藥物防治慢性疾病的重要途徑2，3。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分析，丹酚酸類化合物是酚羥基的供體，具有抗氧化活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本文研究了丹酚酸對二苯代苦味酰肼自由基(DPPH）的清除效應(yīng)，并探討其對

9、體外DNA氧化損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究丹酚酸藥理作用提供科學(xué)依據(jù)。1  材料與方法11  儀器及色譜條件  LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)；DU600紫外-可見分光光度計(jì)(美國Backman公司)；Orion II高靈敏度板式化學(xué)發(fā)光檢測儀(德國Berthold Detection Systems公司)。Alltima C18(150mm×46mm，5m)色譜柱；流動相為水(05冰醋酸)(A)-乙腈(B)；梯度條件：030min時(shí)525,3060min時(shí)2530B；流速10ml/min；柱溫為室溫；檢測波長280nm；進(jìn)樣量20

10、l。12  試劑  丹酚酸B對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111562-200403);二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、DNA、維生素C(VC)(美國Sigma公司)；二丁基羥基甲苯(BHT)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(182M)，其余試劑為分析純。不同含量和組成的丹酚酸水提取物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附樹脂純化物(RE)(本實(shí)驗(yàn)室自制)。13  方法131  DPPH自由基清除法  參照文獻(xiàn)4。反應(yīng)體積為3ml，取05m1不同濃度的樣品加入6×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液中，混勻后

11、室溫下測定DPPH反應(yīng)液在517nm處的吸光度。BHT、VC作對照比較。樣品對DPPH的清除率()=A0-A樣)/A0×100%。A0為DPPH對照在時(shí)間t=0時(shí)的吸光度值，A樣為加有樣品的DPPH t=30min時(shí)的吸光度值。132  清除羥自由基及對DNA損傷的保護(hù)作用  參照文獻(xiàn)5。采用鄰菲羅啉(Phen)-CuSO4-VC-DNA體系檢測清除羥自由基及對DNA損傷的保護(hù)作用。用01mol/L醋酸鹽緩沖液(pH55)配制Phen-CuSO4-VC-DNA溶液，使Phen、Cu2+、VC和DNA的最終濃度分別為35×10-3mol/L、15×

12、;10-4mol/L,28×10-3mol/L、150g/ml。加入一定量的樣品(對照用緩沖液補(bǔ)齊)。取該溶液1ml，放入發(fā)光儀樣品池中，加入200l 30的H2O2溶液，混勻，啟動發(fā)光反應(yīng)，連續(xù)測定發(fā)光強(qiáng)度(CL)。發(fā)光強(qiáng)度抑制率()=(CL對照-CL樣品)/CL對照×100。2  結(jié)果21  丹酚酸清除DPPH自由基的能力  在本實(shí)驗(yàn)條件下，DPPH濃度在560mol/L范圍內(nèi)與517nm下的吸光度有良好線性關(guān)系，Y=00104X+00051(R2=09999)。不同的丹酚酸在各濃度下對DPPH自由基均有清除作用，其清除能力與濃度在一定范圍

13、內(nèi)呈量效關(guān)系。AE、EE、RE、VC、BHT對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)分別為1412，153，146，158，715g/ml。其中，丹酚酸EE、RE和丹酚酸B在525g/ml范圍內(nèi)隨著濃度的增大，清除DPPH能力呈線性增加。當(dāng)樣品濃度進(jìn)一步增大到50g/ml后，其清除能力增加趨于平穩(wěn)，清除反應(yīng)的量效關(guān)系與VC相似。在5200g/ml濃度范圍內(nèi),AE清除DPPH的濃度效應(yīng)呈線性關(guān)系，濃度為200g/ml時(shí)，AE清除DPPH的能力達(dá)到710，接近于同濃度下BHT的水平。實(shí)驗(yàn)觀察了不同樣品在濃度為25g/ml時(shí)對DPPH自由清除能力的動力學(xué)變化(30min)。AE、EE、RE在30m

14、in內(nèi)吸收值均不斷下降，超過30min后仍有下降趨勢。而對照AsA在反應(yīng)啟動后，能快速清除DPPH自由基(6×10-5mol/L)，并達(dá)到平衡。22  對羥自由基損傷DNA的保護(hù)作用  Phen-CuSO4-VC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系中，Phen在金屬離子的催化下與H2O2作用，生成羥自由基，產(chǎn)生最大發(fā)射在445450nm范圍內(nèi)的化學(xué)發(fā)光。羥自由基引起DNA損傷，能產(chǎn)生一延遲于Phen本身氧化發(fā)光信號的慢化學(xué)發(fā)光。最大發(fā)光波長范圍在380420nm。丹酚酸混合物AE、EE和RE均能有效防止羥自由基引起的DNA損傷。當(dāng)AE終濃度分別為200，500，1000

15、，2000g/ml時(shí)，DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光峰延遲時(shí)間分別為180，240，400，1220s；發(fā)光抑制率分別為1374，2664，4650，6893。EE終濃度為25，50，160，200，400g/ml時(shí)，DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光峰延遲時(shí)間分別為320，420，520，940，1980s；發(fā)光抑制率分別為2713，5617，7152，7696，9067。RE終濃度為25，50，100，150，200g/ml時(shí)，DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光峰延遲時(shí)間分別為340，400，800，960，1040s；發(fā)光抑制率分別為3824，4863，6326，7649。丹酚酸的加入能使DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光峰較空白對照組有明顯下降

16、，且有明顯后移現(xiàn)象，濃度越大，作用越強(qiáng)。AE、EE、RE的抑制發(fā)光50的濃度(IC50)分別為12936，620,492g/ml。濃度為200g/ml時(shí)，丹酚酸AE、EE、RE的延遲時(shí)間大小順序?yàn)镽E>EE>AE?？梢?，丹酚酸對DNA氧化損傷的保護(hù)能力大小依次為RE>EE>AE。百事通 23  丹酚酸組成對抗氧化能力的影響231  丹酚酸組份測定  外標(biāo)法測丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度下所得的峰面積，以濃度和對應(yīng)峰面積建立線性回歸方程，Y=15197X+92802(r2=09998)。測得丹酚酸樣品AE、EE、RE中丹酚酸B的純度分別為56，7

17、44，905。AE、EE、RE中除丹酚酸B(保留時(shí)間為28465±010min)外，還存在5個(gè)共有峰，保留時(shí)間(min)分別為20748±005；22498±006,24032±007，25265±008，32698±020。分析各峰面積可知(AE、EE、RE濃度均為2mg/ml)，AE各峰面積均明顯低于EE、RE，顯示AE中總丹酚酸含量低于EE和RE。RE中峰2,3,6的面積分別是EE的112,655,387倍，而峰4,5的面積則低于EE，分別為EE峰面積的6940。232  丹酚酸組成與抗氧化能力的關(guān)系  丹酚

18、酸對DPPH清除能力測定結(jié)果顯示，EE、RE在各濃度下的清除率均明顯高于AE，同時(shí)EE、RE與丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品(純度是993)相比較，相同濃度(25g/ml)下，EE、RE對DPPH的清除率分別為7897和8194,丹酚酸B的清除率為8259?？梢?，丹酚酸B的純度越高，其清除能力越強(qiáng)。在Phen-CuSO4-VC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系中，與DPPH自由基清除能力相似，對DNA氧化損傷的保護(hù)能力大小依次為EE>RE>AE?？梢姡珹E的抗氧化能力明顯低于EE和RE，這與AE中的總酚含量低于EE和RE相一致。233  丹酚酸B含量與抗氧化能力的相關(guān)性  相關(guān)性分

19、析顯示顯示，在DPPH反應(yīng)體系中，丹酚酸B含量低于13g時(shí)，其含量與DPPH自由基清除能力之間有明顯相關(guān)性(R2=08984)，含量進(jìn)一步增大后，清除能力增加緩慢。原因可能是此反應(yīng)濃度下的丹酚酸B能基本清除反應(yīng)中的DPPH(6×10-5mmol/L)。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系中，丹酚酸B的含量與發(fā)光抑制率間的關(guān)系也有明顯的相關(guān)性(R2=08121)。由此推測，丹酚酸B可能是樣品中主要抗氧化物質(zhì)。3  討論本實(shí)驗(yàn)表明，丹酚酸能有效清除DPPH自由基，對羥自由基致DNA損傷具有明顯的保護(hù)作用，并存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，是一種有效的天然自由基清除劑。酚酸類化合物具有清除自由基的結(jié)構(gòu)6，

20、7，不同組成的丹酚酸，由于各單體間結(jié)構(gòu)的差異引起其清除自由基能力的不同。其中丹酚酸B是由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合合成，結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)游離酚羥基。因此，具有很強(qiáng)的提供氫質(zhì)子的能力。從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并能通過清除體系中產(chǎn)生的羥自由基消除對DNA的破壞作用。張健等8把自由基清除劑對DNA損傷的保護(hù)機(jī)制分為3種：延遲DNA損傷，代表斷鏈性作用；抑制DNA損傷，代表預(yù)防性作用；延遲兼抑制DNA損傷，代表斷鏈兼預(yù)防性作用。不同組分的丹酚酸均可有效地清除羥自由基，降低DNA損傷程度且延遲DNA損傷發(fā)生的時(shí)間，表現(xiàn)出了丹酚酸具有斷鏈兼預(yù)防性作用。本次研究重點(diǎn)觀察了丹酚酸在體外2種自由基反應(yīng)模型中的作用，表明其清除DPPH自由基能力及對DNA損傷的保護(hù)作用和丹酚酸B含量有一定相關(guān)性。丹酚酸組分表現(xiàn)出的抗氧化能力可能并不僅僅由于丹酚酸B的直接作用，而存在其他丹酚酸類單體提供的作用和相互影響，具體影響程度和原因有待于對未知丹酚酸峰作深入分析而確認(rèn)。參考文獻(xiàn)1  杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分-丹酚酸研究進(jìn)展J.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20(5)：210-214.2  劉艷妮，沈新南，黃，等.葡萄籽原花青素對糖尿病鼠抗氧化能力影響J.中國