小鼠乙型肝炎e抗原HBeAg酶聯(lián)免疫分析ELISA

1、小鼠乙型肝炎e抗原(HBeAg)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關液體樣本中乙型肝炎e抗原(HBeAg的含量實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠乙型肝炎e抗原(HBeAg)水平。用純化的小鼠乙型肝炎e抗原(HBeAg)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中 依次加入乙型肝炎 e抗原(HBeAg)，再與HRP標記的乙型肝炎e抗原(HBeAg)抗體結合， 形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的乙型

2、肝炎e抗原(HBeAg)呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過 標準曲線計算樣品中小鼠乙型肝炎e抗原(HBeAg)濃度。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份圭寸板膜2 片( 48)2 片(96)密封袋1個1個酶標包被板1 X 481 X 962-8 C保存標準品：2700ng/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存標準品稀釋液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶標試劑3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 m

3、l X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存終止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml X 30 倍)X 1 瓶2-8 C保存樣本處理及要求1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收 集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

4、3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4. 細胞培養(yǎng)上清： 檢測分泌性的成份時， 用無菌管收集。 離心 20 分鐘左右 （2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬 /ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。 離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成， 應再次離心。5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS, PH7

5、.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?8C的溫度。加入一定量的PBS （ PH7.4）,用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分） 。仔細收集上清。 分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20 C保存，但應避免反復凍融.7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔,在第一、第二孔中分別加標準品100M，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50

6、d，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 d分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50d,混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 d棄掉，再各取50d分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50dl 分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50 d，混勻后從第七、第八孔中分別取50 d加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50 d ,混勻后從第九第十孔中各取50 d棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50 d,濃度分別為1800ng/L, 1200ng/L , 600ng/L ,

7、300ng/L， 150ng/L）。2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 d，然后再加待測樣品10 d （樣品最終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔 壁,輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置37C溫育30分鐘。4. 配液：將 30（ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（ 48T 的 20 倍）倍稀釋后 備用。5. 洗滌：小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此重復 5 次,拍干。6. 加酶：每孔加入酶標試劑50 d，空白孔除

8、外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 d，再加入顯色劑 B50 d，輕輕震蕩混勻，37C避光 顯色 15 分鐘 .10. 終止：每孔加終止液 50 d，終止反應（此時藍色立轉黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）。測定應在加 終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。注意事項：1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后 如未用完,板條應裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。3 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，

9、以避免試驗誤差。一次加樣時間 最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后 再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（Xnx 5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 底物請避光保存。7 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.8 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。9 本試劑不同批號組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。計算：以標準物的濃度為橫坐標， OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品 的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度； 再乘以稀釋倍數(shù)； 或用標準物的濃度與 OD 值計 算出標準曲線的直線回歸方程式， 將樣品的 OD 值代入方程式