正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化紫莖澤蘭總黃酮提取的技術(shù)創(chuàng)新

1、正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化紫莖澤蘭總黃酮提取的技術(shù)創(chuàng)新    紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum Spreng）菊科澤蘭屬植物，因其莖、葉柄呈紫色，故名紫莖澤蘭1，是我國(guó)危害最為嚴(yán)重的外來(lái)入侵物種之一2。紫莖澤蘭化學(xué)成分分析文獻(xiàn)顯示，其含倍半萜、甾體、三萜、黃酮、苯丙素酚等類(lèi)型化合物3-4。近年來(lái)，黃酮類(lèi)化合物因其在保護(hù)心血管、抗氧化自由基等方面的功效而受到關(guān)注。摸索紫莖澤蘭中黃酮的提取工藝，利用紫莖澤蘭提取黃酮，原材料經(jīng)濟(jì)、易得，亦為紫莖澤蘭的防治開(kāi)辟一條新的途徑。楊郭等5研究了紫莖澤蘭總黃酮的提取工藝，但沒(méi)有把影響得率的重要因素之一“提取次數(shù)

2、”納入工藝提取設(shè)計(jì)之中，本研究將乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為考察因素優(yōu)化紫莖澤蘭總黃酮提取工藝。1儀器、試劑與材料11主要儀器、試劑721型分光光度計(jì)（四川分析儀器廠）、超聲波器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2型（國(guó)華電器有限公司）、遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱、賽特路斯電子分析天平BS210S型、XA-1型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（銀河實(shí)驗(yàn)儀器廠）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；乙醇（分析純，重慶化學(xué)試劑總廠）；10%硝酸鋁（分析純，天津市化學(xué)試劑三廠）；5%亞硝酸鈉（化學(xué)純，北京化工廠）；1mol/L氫氧化鈉（分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司）。12材料紫莖澤蘭總黃酮含量在發(fā)育過(guò)程中呈不斷上升趨勢(shì)，其在夏季

3、生長(zhǎng)旺盛，夏秋之交黃酮含量較高。在九月份采集成熟、肥厚的紫莖澤蘭葉片（采至昆明市西南林業(yè)大學(xué)校園林地）風(fēng)干備用。在使用前將風(fēng)干的材料置于恒溫干燥箱中，至60烘干，搗碎。2方法采用乙醇浸提法提取紫莖澤蘭中黃酮化合物，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，制作濃度吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)法測(cè)定提取液的吸光度，從而計(jì)算黃酮得率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)影響黃酮得率的主要因素進(jìn)行篩選，從而得到紫莖澤蘭中總黃酮的最佳提取工藝。在測(cè)定樣品吸光度時(shí)，加入亞硝酸鈉，防止黃酮類(lèi)化合物被氧化；加入硝酸鋁，形成黃酮鋁絡(luò)合物，增強(qiáng)其吸光度；最后，加入氫氧化鈉，使其吸收峰紅移，利于排除其他物質(zhì)的干擾。21標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作211標(biāo)

4、準(zhǔn)曲線制作方法精密稱取蘆丁對(duì)照品0125g，將其溶解于適量乙醇中，用乙醇定容至100ml，搖勻，精密吸取10ml置25ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得每1ml中含無(wú)水蘆丁05mg溶液。精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5ml，分別置于25ml容量瓶中，各加水至5ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6分鐘；加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6分鐘；加1mol/L氫氧化鉀10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘。分光光度法，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。并以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。212標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方程按上述方法操作，測(cè)得不同濃度下的吸光度A值，結(jié)果見(jiàn)表1。并以

5、吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制出AC標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果統(tǒng)計(jì)表對(duì)照品溶液體積（ml）012345蘆丁（mg/ml）00000200400600801吸光度0000004100800123016402圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線蘆丁濃度（mg/ml）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（X）與吸光度（Y）作線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=201X+0001；R2=09995。從該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其相關(guān)系數(shù)可以看出，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。22紫莖澤蘭中黃酮類(lèi)化合物得率的測(cè)定將1g紫莖澤蘭的乙醇浸提液烘干，定容至10ml，再取1ml，分別加入亞硝酸鈉、硝酸鋁以及氫氧化鈉溶液，定容后測(cè)其吸光值，計(jì)算其黃酮類(lèi)化合

6、物的得率。其計(jì)算公式為E=（Y-0001）/201。式中，Y為測(cè)得的吸光度。23正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，影響紫莖澤蘭得率的因素很多，影響較大的有提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)， 影響較小的有提取溫度、提取濃度。因此，對(duì)提取溫度和提取濃度作單因素試驗(yàn)，對(duì)提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)做多因素試驗(yàn)。3結(jié)果與分析31實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)得率影響的試驗(yàn)稱取10000+00005g紫莖澤蘭干葉子，分別在60、70、80、90的水浴鍋中進(jìn)行回流，時(shí)間為05h，液料比為120，次數(shù)為1次，趁熱過(guò)濾。吸取濾液1ml，測(cè)定吸光度Y值。結(jié)果見(jiàn)下表：表2提取溫度對(duì)黃酮得率影響結(jié)果統(tǒng)計(jì)表溫度（）吸光度平均值料重6001180

7、11901000160012009998700120012251000470012510002800112012100999880013010002900120011550999990011110000從上圖表可以看出，隨著溫度的升高，黃酮得率隨之升高，在70時(shí)達(dá)到最大值。如果溫度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)其它雜質(zhì)溶出增多、溶劑消耗過(guò)大等負(fù)面影響。32乙醇濃度對(duì)得率影響的試驗(yàn)稱取10000+00005g紫莖澤蘭葉，分別用60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇，在70下提取05小時(shí)，趁熱過(guò)濾。吸取濾液1ml，測(cè)定吸光度Y值。表3乙醇濃度對(duì)黃酮得率影響結(jié)果統(tǒng)計(jì)表乙醇濃度（%）重量（g）吸光度601

8、000301226510005013070100010211750999801548009997013685100030122從表3可以看出，隨著乙醇濃度的增加，吸光度也隨之增加，當(dāng)乙醇濃度在70%時(shí)，吸光度最高，之后，吸光度隨乙醇濃度的增高而降低。33正交試驗(yàn)以提取時(shí)間、提取次數(shù)和液料比為考察因素，以黃酮類(lèi)化合物的得率為考察指標(biāo)，選用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以考察提取得最佳工藝。各考察因素及其水平見(jiàn)表4。表4正交試驗(yàn)因素及其水平水平液料比（ml/g）時(shí)間（h）次數(shù)15115120122251253根據(jù)上表中的各條件提取，取提取液1ml，測(cè)定其吸光度Y，結(jié)果見(jiàn)表5：表5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果統(tǒng)計(jì)

9、表液料比（ml/g）時(shí)間（h）次數(shù)吸光度得率（%）115115101250622151220123061315125301450714201152011105552012301450716201251013306672511530130064825121013106492512520147073均值1013101220130均值2013001330127均值3013601420140極差0006002000134結(jié)論各考察因素對(duì)黃酮得率的影響程度不同，按其影響     的主次順序，依次為時(shí)間>次數(shù)>液料比。所得最佳工藝為：乙醇濃度70%，液料比為151，提取溫度為70，提取時(shí)間為25h，提取次數(shù)為3次。該工藝所用溶劑常用廉價(jià)，提取溫度較低，產(chǎn)量高，有利于降低能耗，降低成本，最大限度保證產(chǎn)率。參考文獻(xiàn)1劉倫輝，等.紫莖澤蘭個(gè)體生物及生態(tài)學(xué)特性研究J.生態(tài)學(xué)報(bào)，1989，9（1）：6670.2高志勇，郭秦嶺，孫強(qiáng).紫莖澤蘭研究概況J.陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，33：94.3魯萍，桑衛(wèi)國(guó)，馬克平.外來(lái)入侵種紫莖澤蘭研究進(jìn)展與展望J.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，29（6）：1029-1037.4閆乾勝，