川芎嗪對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用及抗細(xì)胞凋亡作用

1、川芎嗪對大鼠腎臟缺血/再灌注損傷保護(hù)作用及抗細(xì)胞凋亡作用         08-10-13 09:50:00     編輯：studa20        作者：王漢民，譚華，趙洪雯，張鵬，黃朝暉，何麗潔，陳光磊，吳雄飛 【摘要】  目的: 探討川芎嗪對缺血/再灌注（I/R）損傷大鼠腎功能、腎臟組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響. 方法: 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（S）組、I/R組、再灌

2、注后給予川芎嗪（TMPpost）組、再灌注前給予川芎嗪（TMPpre）組，各組分別采用化學(xué)法測定血尿素氮和肌酐，光鏡和電鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化，原位末端標(biāo)記法檢測腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)，免疫組化和免疫印跡法檢測腎臟Bcl2和Bax蛋白的表達(dá). 結(jié)果: TMPpre組較I/R組血尿素氮和肌肝顯著降低，腎小管損傷評分減輕，分別為（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P0.01) ，（196±55）vs （295±64）mol/L，P0.01），(372±46) vs （563±62），P0.01) ；腎小管上皮細(xì)胞損傷及

3、超微結(jié)構(gòu)改變明顯減輕，腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少（13.6±2.9） vs （28.8±4.6），P<0.01）；Bcl2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（1.15±0.12） vs （0.88±0.12），P<0.05），Bax表達(dá)明顯減弱（0.87±0.11） vs （1.15±0.09），P<0.05）. 結(jié)論: 川芎嗪可明顯減輕I/R腎損傷，其保護(hù)作用機(jī)制與Bcl2蛋白表達(dá)增強(qiáng)和Bax蛋白表達(dá)減弱介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡有關(guān). 【關(guān)鍵詞】  川芎嗪；腎臟；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；保護(hù)【Abstract】AIM: To exp

4、lore Ligustrazine (Tetramethylpyrazine, TMP) on the effect of in rats wit rat renal functions, renal tissue morphology, cell apoptosis and expressions of  related genes in rats with. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I

5、/R model(n=10), TMPpost (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg per 6 h after reperfusion for 30 min) and TMPpre (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia) groups. Blood urea nitrogen and creatinine were detected by chemical method. Renal cell apoptotic index was examine

6、d by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax in kidney was immunohistochemically evaluated and quantified by Western Blot analysis. The kidney histology were observed by light and electron microscope. RESULTS: Compared wit

7、h those in the TMPpre group, the blood urea nitrogen（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P0.01, the creatinine （196±55） vs （295±64）mol/L，P0.01） and the score of injury in renal tubules (372±46) vs （563±62），P0.01) were decreased significantly in I/R group. The changes of injur

8、y and ultrastructure in tubular epithelial cells were significantly attenuated in TMPpre group. By Tetramethylpyrazine pretreatment, the apoptotic index (13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax (0.87±0.11 vs 1.14±0.09, P<0.05) were decreased significantly, a

9、nd the expression of Bcl2(1.15±0.12 vs 0.88±0.12, P<0.05) was increased significantly as compared with that in I/R group. CONCLUSION: Tetramethylpyrazine can attenuate kidney I/R injury, and protective mechanism may be partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expres

10、sions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.【Keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; protection0  引言    川芎嗪是從傘形科植物川芎根莖中分離提純的一種生物堿單體，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用，臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療，并取得較好療效. 川芎嗪對腎臟缺血/再灌注（I/R）損傷的保護(hù)作用已被大量研究證實(shí)1-2，但這種保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚，我們通過觀察川芎

11、嗪對I/R損傷大鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討川芎嗪對腎I/R損傷的保護(hù)作用機(jī)制.1  材料和方法1.1  材料  健康成年Wistar大鼠40只，雌雄不拘，體質(zhì)量200240 g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），動(dòng)物許可證號SCXK（軍2002005），標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食水，普通光照. 兔抗大鼠Bcl2和Bax mAb、兔抗actin（Santa Cruz公司）；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；原位細(xì)胞凋亡(TUNEL)試劑盒（美國Roche公司）；細(xì)胞裂解液（美國BDBiosciences公

12、司）；BCA試劑盒（美國Pierce公司）；SDS聚丙烯酰胺凝膠（美國Invitrogen公司）；硝酸纖維素膜（美國Life Science公司）；血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（無錫第七制藥廠，批號02081911）. JEM100SX型透射電鏡（日本JEOL公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Kodak公司）等.1.2  方法1.2.1  分組及動(dòng)物模型制備  將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只. S組：假手術(shù)對照組；I/R組：缺血再灌注模型組；TMPpost組：在I/R模型的基礎(chǔ)上，再灌注30 min后腹腔注

13、射川芎嗪，32 mg/kg，每6 h 1次，共4次；TMPpre組：在制備I/R模型前24，16，8 h，45 min腹腔注射川芎嗪, 32 mg/kg，I/R造模后不再注射川芎嗪. I/R模型制作參照Basile等方法進(jìn)行3，用30 g/L戊巴比妥鈉3050 mg/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)腹正中切口暴露雙側(cè)腎臟，游離腎蒂，用無損傷動(dòng)脈夾同時(shí)鉗夾雙側(cè)腎動(dòng)脈，阻斷45 min后松開動(dòng)脈夾. 假手術(shù)組僅游離雙側(cè)腎臟，暴露60 min后再關(guān)閉腹腔切口. 24 h后再用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采血并摘取左腎，血標(biāo)本以4000 r/min 離心10 min，分離血清，置-20保存用于測定BUN和Cr. 取部分腎

14、組織分別用40 g/L甲醛和30 mL/L戊二醛固定以制備石蠟切片和電鏡切片，另取部分腎組織迅速置入液氮中，然后于-80冰箱保存，用于提取蛋白.1.2.2  腎功能測定  測定血BUN采用二乙酰一肟顯色法，測定血Cr采用堿性苦味酸比色法，應(yīng)用721分光光度計(jì)測定.1.2.3  腎組織學(xué)觀察  石蠟切片行HE和PAS染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變，參照Paller等方法進(jìn)行評分4，每只大鼠腎組織隨機(jī)選擇10個(gè)視野（×200），每個(gè)視野下隨機(jī)選擇10處腎小管，共按100個(gè)腎小管計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高表示腎小管損傷程度越嚴(yán)重. 電鏡切片行醋酸鈾和枸櫞酸鉛染

15、色，在透射電鏡下觀察腎組織的超微結(jié)構(gòu)變化.1.2.4  腎組織細(xì)胞凋亡檢測  采用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)，參照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行，顯色采用DAB試劑盒進(jìn)行. 光鏡觀察凋亡細(xì)胞，胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞. 于陽性表達(dá)分布區(qū)域、光鏡200倍下隨機(jī)選擇5個(gè)無重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，以凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）.1.2.5  腎組織Bcl2，Bax免疫組化染色  采用兔抗鼠Bcl2和Bax mAb，參照抗Bcl2和Bax試劑盒進(jìn)行，顯色采用DAB試劑盒進(jìn)行. 光鏡觀察胞質(zhì)中有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞.1.2.6

16、0; Western Blot檢測腎組織Bcl2，Bax蛋白表達(dá)  稱取腎組織，按常規(guī)加入細(xì)胞裂解液，進(jìn)行組織勻漿，取上清液用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)100 10 min 變性后，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離. 電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用麗春紅染液染膜，脫脂奶粉于室溫封閉，與Bcl2，Bax抗體37孵育4過夜. 搖洗并加入二抗室溫孵育，再次洗滌，滴加顯色液至硝酸纖維素膜上，X光膠片感光，用Kodak凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描.     統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料用 x±s表示，多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用

17、多個(gè)均數(shù)間的多重比較（Dunnettt檢驗(yàn)），應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2  結(jié)果2.1腎功能的變化  各組血BUN和Cr變化見表1.表1  各組血BUN和Cr、凋亡指數(shù)及腎小管損傷程度評分的比較（略）aP0.05，bP0.01vs I/R組. S：對照組；I/R：缺血/再灌注組；TMPpost：I/R造模后給予川芎嗪；TMPpre：I/R造模前給予川芎嗪. 2.2  腎組織形態(tài)學(xué)改變  各組腎小管損傷程度評分結(jié)果見表1. S組光鏡觀察腎組織無明顯病變，電鏡亦未見明顯異常. I/R組光鏡可見皮髓間有明

18、顯淤血帶，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣消失，出現(xiàn)空泡、滴狀變性，嚴(yán)重者細(xì)胞脫落、壞死、基底膜裸露. TMPpost組光鏡改變較I/R組有所減輕，而TMPpre組光鏡改變較I/R組明顯減輕，表現(xiàn)為部分腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、空泡及滴狀變性少見、部分管腔擴(kuò)張、可見少量管型. I/R組電鏡可見部分腎小管上皮細(xì)胞核染色質(zhì)致密，成團(tuán)塊狀附在核膜上，出現(xiàn)染色質(zhì)邊集，上皮細(xì)胞空泡變性、刷狀緣消失、線粒體減少或消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張. TMPpost組腎小管細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷較I/R組有所減輕. TMPpre組腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度較I/R組明顯減輕：表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞大部分結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體腫脹，少見空泡形成

19、，核膜完整.     08-10-13 09:50:00     編輯：studa202.3腎組織細(xì)胞凋亡的變化  各組腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)見表1，TUNEL檢測腎組織凋亡細(xì)胞結(jié)果見圖1. A：對照組；B：缺血/再灌注（I/R）組；C：I/R造模后給予川芎嗪；D：I/R造模前給予川芎嗪.圖1  各組TUNEL免疫組化染色  SABC ×400（略）2.4  Bcl2，Bax蛋白表達(dá)  在TMPpre組腎小管上皮細(xì)胞中Bcl2表達(dá)明顯，而Bax在I/

20、R組腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯（圖2，3）. Western Blot檢測支持腎組織免疫組化染色的結(jié)果，采用灰度掃描顯示Bcl2在TMPpre組表達(dá)最高，而Bax在I/R組表達(dá)最高（圖4，5）.3  討論    腎臟I/R損傷是休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷及腎移植過程中一種常見的病理生理現(xiàn)象，可以導(dǎo)致急性腎衰竭（ARF）和移植腎功能喪失，在這一過程中最先受到損傷的細(xì)胞是腎小管上皮細(xì)胞. 研究表明5，腎臟I/R損傷后除發(fā)生細(xì)胞壞死外，細(xì)胞凋亡也是其重要的死亡形式. 細(xì)胞凋亡受多種凋亡相關(guān)基因及其蛋白的調(diào)控，Bcl2家族就是其中之一，對細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)控作用6. 大量的

21、研究7-8證實(shí)缺血性ARF時(shí)存在腎臟細(xì)胞凋亡，本研究得出了相似的結(jié)果：I/R組腎功能損傷明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，提示腎臟細(xì)胞凋亡數(shù)量與腎功能損傷程度密切相關(guān).A：對照組；B：缺血/再灌注（I/R）組；C：I/R造模后給予川芎嗪；D：I/R造模前給予川芎嗪.圖2  各組Bcl2免疫組化染色  SABC ×400（略）凋亡是缺血性損傷后細(xì)胞死亡的重要形式，細(xì)胞凋亡受多種凋亡相關(guān)基因及其蛋白的調(diào)控，與凋亡相關(guān)的基因通常分為抗凋亡基因和促凋亡基因. Bcl2是一種重要的抗凋亡基因蛋白，而Bax為Bcl2 家族成員，其作用則與Bcl2 相反，具有促凋亡作用. Reed9認(rèn)為

22、，Bcl2高表達(dá)或Bcl2/Bax比值升高可抑制Bax的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡. 本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用川芎嗪能使腎臟I/R過程中細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，Bcl2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bax 蛋白表達(dá)減弱，Bcl2/Bax比值增高. 表明川芎嗪能抑制腎臟I/R過程中腎臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且川芎嗪的腎臟保護(hù)作用與抑制Bcl2/Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，提示在腎臟I/R損傷中，細(xì)胞凋亡是可以預(yù)防的.    大量的研究10-11證實(shí)川芎嗪對I/R損傷的腎臟有明顯的保護(hù)作用. 本研究結(jié)果表明，腎臟I/R前后應(yīng)用川芎嗪均具有腎臟保護(hù)作用，在I/R前給予川芎嗪效果更明顯，表現(xiàn)在TMPpre

23、組腎功能明顯好轉(zhuǎn)，腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕. 我們推測：早期應(yīng)用川芎嗪能在腎臟缺血期及再灌注早期對抗細(xì)胞損傷因子，穩(wěn)定線粒體膜，從而更好地保護(hù)腎臟細(xì)胞，而晚期給藥則難以在短期內(nèi)緩解細(xì)胞已遭受的嚴(yán)重?fù)p傷.A：對照組；B：缺血/再灌注（I/R）組；C：I/R造模后給予川芎嗪；D：I/R造模前給予川芎嗪.圖3  各組Bax的免疫組化染色  SABC  ×400（略）圖4  Western Blot檢測各組Bcl2和Bax蛋白表達(dá)（略） A：對照組；B：缺血/再灌注（I/R）組；C：I/R造模后給予川芎嗪；D：I/R造模前給予川芎嗪

24、.aP0.05，bP0.01 vs I/R組.圖5  各組Bcl2和Bax蛋白表達(dá)（略）   本研究可得出以下結(jié)論：腎臟I/R損傷時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，Bcl2和Bax 蛋白表達(dá)較正常增強(qiáng)，Bcl2/Bax比值下降，腎功能惡化. I/R前應(yīng)用川芎嗪能減少腎臟細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl2蛋白并同時(shí)下調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，明顯改善腎功能. 因此，川芎嗪對腎臟I/R損傷，可通過調(diào)節(jié)Bcl2和Bax蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡起到腎臟保護(hù)作用.【參考文獻(xiàn)】  1 Feng L, Xiong Y, Cheng F, et al. Effect of ligustra

25、zine on ischemiareperfusion injury in murine kidneyJ. Transplant Proc, 2004, 36(7):1949-1951.2 王 忠，翁國星，杜 建. 川芎嗪對缺血再灌注腎保護(hù)作用的研究J. 福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，15（2）：26-27.3 Basile DP, Donohoe D, Cao X, et al. Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat: a new model to study cytoprotectionJ. Kidney Int, 2004, 65(6):2201-2211.4 Paller MS, Hoidal JR, Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the ratJ. J Clin Invest, 1984, 74(4):1156-1164.5 Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, et al. Induction of apoptosis in ischemiareperfusion model of mouse kidney: possible inv