射頻能量在治療關(guān)節(jié)軟骨退變中對軟骨細胞及基質(zhì)的影響

1、射頻能量在治療關(guān)節(jié)軟骨退變中對軟骨細胞及基質(zhì)的影響                作者：孫建華劉維鋼史晨輝王永明 董金波李寬新何斌【關(guān)鍵詞】  細胞死亡   摘要：目的實驗研究射頻消融能量大小與關(guān)節(jié)軟骨細胞及基質(zhì)損傷效應(yīng)之間的關(guān)系。方法建立牛膝關(guān)節(jié)軟骨退變模型，模擬膝關(guān)節(jié)鏡環(huán)境，射頻消融氣化儀在15、40、70 W的不同能量設(shè)置條件下，處理牛膝關(guān)節(jié)退變軟骨1 min，同時設(shè)置對照組，共分4組，每組6份標本，隨后行軟骨組織塊培養(yǎng)

2、，HE染色，F(xiàn)DAPI雙熒光染色，GAG釋出率。結(jié)果隨著射頻消融能量的增加，空泡率明顯增加，軟骨細胞死亡率明顯增加，GAG釋出率明顯減少。結(jié)論隨著射頻消融輸出能量的增加，軟骨細胞死亡率明顯增加，軟骨基質(zhì)損傷明顯加重，射頻消融能量大小與關(guān)節(jié)軟骨細胞及基質(zhì)的損傷呈正相關(guān)關(guān)系。關(guān)鍵詞：射頻消融；細胞死亡； 細胞外基質(zhì)Effects of radiofrequency energy on degenerative articularAbstract：ObjectiveTo study the effect of radiofrequency energy on chondrocytes and mat

3、rix of traumatic degenerative articular cartilageMethodTraumatic degenerative arthritis models were established in 24 bovine knees,which were divided into 4 groups:15w group (A),40w group(B)70w group (C) and control group untreated(D)After the degenerative cartilages of group A,B,C were treated resp

4、ectively for 1 min with 15w,40w,70w radiofrequency energy,the cartilage blocks were cultured and examined with HE stain and FDA (flurescein diacetate) /PI (propidium iodide) double fluorescent stain,and GAG (glucosamineglucan) release rate was measuredResultFollowed the enhance of radiofrequency ene

5、rgy strength,the vacuolization rate and mortality rate of cartilage cells were correspondently increased (P005),but GAG release rate was decreased (P005)ConclusionThe results shows that there are positive correlation between the strength of radiofrequency energy and degree of matrix damage as well a

6、s mortality of cartilage cellsKey words：Radiofrequency energy；  Degenerative cartilage； Arthritic knee射頻技術(shù)在關(guān)節(jié)軟骨成形術(shù)中的應(yīng)用日益廣泛。但由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏神經(jīng)、血管及淋巴系統(tǒng)，受損后自身修復能力有限，而射頻治療產(chǎn)生的熱量可能對軟骨細胞及基質(zhì)有損傷效應(yīng)1。因此射頻能量在軟骨成形術(shù)中的安全性目前逐步受到重視。作者在模擬關(guān)節(jié)鏡環(huán)境下，對比研究不同射頻消融能量對正常軟骨細胞的即時損傷，報道如下。1  材料與方法11   標本及分組111  關(guān)節(jié)

7、軟骨退變模型制作及設(shè)備準備當?shù)赝涝讏龅玫叫迈r完整的牛膝關(guān)節(jié)6副，無菌條件下暴露股骨髁部關(guān)節(jié)軟骨面，刀片輕輕刮除表面軟骨膜，骨銼銼光關(guān)節(jié)軟骨表面，制作級軟骨退變模型。射頻消融設(shè)備是SERFAS雙極射頻氣化儀(Stryker公司)，消融電極型號為278500350。112 標本分組及參數(shù)設(shè)定射頻消融對象以單元格為單位，每幅牛膝關(guān)節(jié)軟骨選擇4個單元格(1 cm×1 cm)。參數(shù)設(shè)定選擇CUT1、CUT3、CUT5，相對應(yīng)輸出能量為15、40、70 W，其中選3個單元格分別用相應(yīng)射頻消融能量處理1 min，另一組未經(jīng)射頻消融能量處理的單元格作為正常對照組。共分4組，每組6份標本。12 標本培

8、養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨處理后，日期記錄為第1 d，依照網(wǎng)格線全層取下關(guān)節(jié)軟骨，沿中央切開，分為A、B兩部分，A組織塊(1 cm×05 cm)直接放入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基，100 mlLFBS，37 50 mlL CO2)，用于軟骨細胞活性檢測。B組織塊電子天平稱質(zhì)量并記錄，無菌下切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，放入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基10 ml，用于葡糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）釋出率測定。每日換液。13 軟骨組織塊即時損傷觀察指標131   HE染色培養(yǎng)后第4 d，將A組織塊分為A1、A2 2部分，將A

9、1組織塊放入10%福爾馬林溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、制作蠟塊、切片、HE染色，在顯微鏡下觀察，壞死細胞的細胞核散大、消失，呈空泡狀。高倍鏡下取10個視野（表層5個，中層5個），細胞空泡率=空泡細胞/細胞總數(shù)×100%。132 細胞活性檢測培養(yǎng)后第2 d，A2組織塊用雙面剃刀切成05 mm薄片，放入含3 mg/L二乙酸熒光素（flurescein diacetate,FDA)PBS液中，37 孵育5 min，然后，放入含10 mg/L碘化麗啶（propidium iodide,PI）PBS液孵育1 min，PBS液沖洗3遍，倒置熒光顯微鏡下觀察。在藍色激發(fā)光下活細胞呈綠色，在紅色激發(fā)光

10、下死細胞呈鮮紅色。使用雙重曝光拍照，每份切片取6個視野（表層3個，中層3個）死亡率=死亡細胞/（死亡細胞+活細胞）×100%。133  軟骨組織GAG釋出率測定第4 d，把B組織塊前3 d收集的培養(yǎng)基用阿利新藍法測定GAG（glycosaminoglycan）含量2。根據(jù)組織塊的原始質(zhì)量，換算成GAG釋放率。GAG相對釋出量=GAG含量/組織塊質(zhì)量。統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS 110統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析法。2 結(jié)果21 HE染色對照組空泡率為1896%，15 W為2795%，與對照組相比，差異無顯著性（P005）。當輸出能量增加至40、70 W時，軟骨細胞空泡率分別增

11、加至5507%、6513%，與對照組相比，軟骨細胞空泡率明顯增加（P005),結(jié)果見表1。22  細胞活性檢測對照組死亡率為1783%，15 W為4465%，兩組相比，差異無顯著性（P005）。當輸出能量增加至40 W及70 W時，軟骨細胞死亡率為100%，與對照組相比差異具有顯著性（P005），結(jié)果見表1。表1 細胞活性檢測軟骨細胞空泡率及死亡率(略)注：*與對照組比較         23 軟骨組織GAG釋出率測定射頻消融輸出能量達到15 W時，前2 d GAG相對釋出率較對照組雖無顯著性差異（P00

12、5），但釋出率已經(jīng)開始下降，輸出能量增加至40 W及70 W時，GAG相對釋出率較對照組下降明顯（P005）,第3 d，各組間GAG相對釋出率差異雖不顯著（P005），但隨著輸出能量的增加，GAG相對釋出率仍在減少，結(jié)果見表2。表2軟骨組織GAG釋出率(略)注：*與對照組相比P0053  討論31  射頻消融能量大小對關(guān)節(jié)軟骨細胞的影響目前在軟骨成形術(shù)中，對射頻消融能量安全性的認識并不一致1。本研究HE染色結(jié)果顯示，對照組空泡率為1896，15 W組為2795，與對照組相比，差異無顯著性(P005)。當輸出能量增加至40、70 W時，軟骨細胞空泡率分別增加至5507、651

13、3，與對照組相比，軟骨細胞空泡率明顯增加(P005)。熒光染色結(jié)果顯示，對照組死亡率為1793，15 W組為4465，兩組相比，差異無顯著性(P005)。當輸出能量增加至40 W及70 W時，軟骨細胞死亡率為100，與對照組相比差異具有顯著性(P005)，且變性、壞死的空泡細胞與死亡的軟骨細胞多集中于軟骨表層。提示隨著射頻消融輸出能量的增加，處理區(qū)域死亡的軟骨細胞也隨之增加，表層軟骨細胞因離電極較近，較中層及底層軟骨細胞相比，受到1王立勛,摘譯.射頻能量在治療關(guān)節(jié)軟骨面不平中對軟骨細胞及基質(zhì)的作用J.國外醫(yī)學骨科學分冊，2004，25(2)：127128.2 張惟杰.復合多糖生化研究技術(shù)M.第

14、2版，上海：上?？萍汲霭嫔纾?988，290.3 Ryan A,Bertone AL,Kaeding CC，et al.The effects of radiofrequency energy treatment on chondrocytes and matrix of fibrillated articular cartilageJ.Am J Sports Med,2003,31(3):386391.4 Lu Y,Hayashi K,Hecht P,et al.The effect of monopolar radiofrequency energy on partialthickness defects of articular cartilageJ.Arthroscopy,2000,16(5):527536.5 Kaplan.The acute effects of radiofrequency energy in articular cartilageJ.Arthroscopy,2000,16(8):87