黃芩莖葉總黃酮對A引起癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

1、黃芩莖葉總黃酮對A引起癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響        【摘要】     目的觀察黃芩莖葉總黃酮對大鼠雙側(cè)海馬注射A2535引起的學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元形態(tài)的影響。方法將30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、總黃酮組?？瞻讓φ战M灌胃蒸餾水，1次/d，共7 d，第8天，海馬注射生理鹽水，繼續(xù)灌胃；模型組第8天海馬注射A2535 5 l含10 g，其它同對照組；給藥組50 mg/kg總黃酮每天灌胃1次，共7 d，第8天海馬注射A25-35，繼續(xù)灌胃，各組于

2、第15天采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，1次/d，測5 d，處死，Nissl染色觀察海馬錐體細(xì)胞的變化。結(jié)果模型組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞帶脫失，不完整，細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，給藥組大鼠逃避潛伏期較模型組縮短，細(xì)胞損傷較輕。結(jié)論黃芩莖葉總黃酮對海馬注射A2535引起的學(xué)習(xí)記憶損傷及海馬神經(jīng)元形態(tài)變化具有保護(hù)作用。     【關(guān)鍵詞】  阿爾茨海默病 淀粉樣蛋白 黃芩莖葉總黃酮    The Effect of Total Flavonoid of Scutella

3、rea Baicalensis Stem-leaf against Learning and Memory Deficit  Induced by A2535 Injection in Rat Hippocampus    YE Hong, WANG Ruiting, ZUO Yanzhen, GUAN Lihua, SHEN Xingbin    (Chengde Medical College, Chengde 067000, China)    Abstract:ObjectiveTo i

4、nvestigate the protection of SSTF on memory deficit, neuronal degeneration  induced by bilateral injection A2535 in rat hippocampus.Methods30 male Wistar rats were randomly divided into three groups. The distilled water  was given (ig, 1/d) to the comparision group and the model group, SSF

5、 (ig 50mg/kg/d  1/d)was given to SSF group. On the eighth day  saline or A was injected to bilateral hippocampus of the control group or the model and SSF group .  Morris water maze task was used to evaluate the memory on the fifteenth day,once for 5d. Nissl staining was used to inves

6、tigate the change of hippocampus nerve cells.ResultsThe model group resulted in a significantly increased latency to find the hidden platform . SSF group resulted in a significantly reduced latency as compared with the model group. The pathological changes included neuron loss,nuclear disappearance

7、in the model group. SSF group showed the reduced damage compared with the model group .ConclusionSSF may be beneficial for improving the learning and memory deficit induced by A25-35.    Key words:Alzheimer's disease;  Amyloid-beta protein;  Total flavonoid of Scutellare

8、a Baicalensis stem-leaf (SSTF)    阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）亦稱老年性癡呆癥，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，與年齡的增長密切相關(guān)。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究主要集中在氧自由基、炎癥因子及中樞神經(jīng)元凋亡3個(gè)方面。黃芩是我國傳統(tǒng)的中草藥，眾多研究集中在其有效成分黃酮類化合物的研究上，研究表明黃芩莖葉總黃酮具有抗炎、抗免疫、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、治療腦缺血等作用1。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠海馬內(nèi)注射淀粉樣蛋白（A）致大鼠癡呆模型，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察黃

9、芩莖葉總黃酮（SSTF）對癡呆大鼠學(xué)習(xí)、記憶的影響。    1  材料    1.1  動物雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（280±20）g, 動物證號712123，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)；自然光線，自由進(jìn)食水。    1.2  試劑A2535由Sigma公司提供，黃芩莖葉總黃酮由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，純度61.88。    2  方法    2.1  分

10、組及處理將Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只?？瞻讓φ战M大鼠給予蒸餾水灌胃，1次/d，7 d，第8天雙側(cè)海馬各注射5 l的無菌生理鹽水，繼續(xù)灌胃給蒸餾水；模型組第8天雙側(cè)海馬各注射凝膠態(tài)A2535 5 l含10 g, 其它同空白對照組。給藥組黃芩莖葉總黃酮50 mg/（kg·d）灌胃，1次/d，7 d，第8天雙側(cè)海馬各注射凝膠態(tài)A2535 5 l含10 g，繼續(xù)灌胃給藥，3組大鼠于第15天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測5 d后處死。    2.2  制作動物模型大鼠灌胃第8天，用4的水合氯醛腹腔麻醉（1 ml/100 g），固定于腦立體定位儀（江

11、灣1號C型腦立體定向儀），剪去頭頂部毛發(fā)，于AP -3.5 mm，ML ±2 mm，DV 2.7mm定位海馬，用三棱針鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器5 min內(nèi)緩慢注入A（A溶于無菌生理鹽水2 g/L,20保存，臨用前置于37孵育7 d成凝膠態(tài)），留針2 min，緩慢撤針，肌注青霉素3 d，1次/d，10萬u。    2.3  Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)迷宮裝置由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，圓形不銹鋼水池，直徑120 cm,高60 cm，水池底和筒壁皆為黑色；將水池等分為4個(gè)象限；目標(biāo)象限的中央放置一直徑為10 cm，高23.5 cm的圓

12、形隱藏平臺，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間其位置保持不變；水池中水面高于平臺1.5 cm，水溫（21±1）；水池周圍安裝環(huán)形布簾，實(shí)驗(yàn)期間迷宮周圍參照物不變，迷宮上方安置攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動軌跡。實(shí)驗(yàn)前動物自由游泳2 min，如果大鼠找不到平臺，將大鼠放在平臺20 s, 每天將大鼠從4個(gè)象限點(diǎn)面向池壁各測驗(yàn)兩次，記錄動物尋找并爬上平臺所需時(shí)間，如果動物在60 s內(nèi)未找到平臺，由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺，潛伏期記為60 s。第12天為訓(xùn)練，后3 d數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)、記憶成績。    2.4  取材、固定、切片、染色動物麻醉后，經(jīng)左心室快速灌注250 ml的生理鹽水，然后

13、灌注含4多聚甲醛的PB液250 ml(先快后慢)進(jìn)行固定，1 h后取腦，后固定過夜，脫水，石蠟包埋，行冠狀切片，片厚5 m，切片取含海馬部位，用硫堇作Nissl染色。    2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s，用SSPS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。    3  結(jié)果    3.1  Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的逃避潛伏期較空白對照組明顯延長（P<0.05）, 藥物組與模型組相比明顯縮短（P<0.05）。表1  各組大鼠在隱藏平臺的平均逃避

14、潛伏期與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；n=10    3.2  海馬的Nissl 染色模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞帶脫失，不完整，核邊聚，部分錐體細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，注射針道附近可見膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生?？瞻讓φ战M細(xì)胞帶完整，排列有序，未見明顯的細(xì)胞增生，給藥組錐體細(xì)胞損傷較小，膠質(zhì)細(xì)胞增生不明顯。    4  討論    阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）是一種以進(jìn)行性記憶力下降和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系

15、統(tǒng)變性疾病，其主要的病理特征是腦內(nèi)細(xì)胞外老年斑（SP）和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)形成(NFT)，老年斑的核心是淀粉樣肽（A）沉積，A沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。體內(nèi)產(chǎn)生的A有兩種即A140，A142，凝聚態(tài)的A可構(gòu)成淀粉樣蛋白纖維，體外凝聚態(tài)A與AD患者腦中的A有相似的結(jié)構(gòu)，其中2535位的氨基酸序列的多肽片斷是A的生物活性片斷。多項(xiàng)研究表明A體內(nèi)、體外均可引起學(xué)習(xí)記憶功能減退及細(xì)胞形態(tài)改變24。本實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)海馬注射A2535引起大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的減退，Morris實(shí)驗(yàn)顯示模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，給藥組較模型組的逃避潛伏期明顯縮短，Nissl染色顯示模型組CA1區(qū)錐體細(xì)胞帶脫失，不完整，部分

16、錐體細(xì)胞出現(xiàn)核邊聚，出現(xiàn)空泡樣變性。結(jié)果顯示凝聚態(tài)A對海馬神經(jīng)元造成了損傷，黃芩莖葉總黃酮對A引起的損傷有一定保護(hù)作用。    A引起錐體細(xì)胞損傷，學(xué)習(xí)、記憶能力減退的機(jī)制研究主要集中在氧自由基、炎癥因子、神經(jīng)元凋亡方面。A本身可產(chǎn)生活性氧（ROS），也可通過多種途徑誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，使神經(jīng)細(xì)胞胞漿中自由基濃度升高，使脂質(zhì)過氧化，形成脂質(zhì)過氧化物，當(dāng)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)氧化損傷后，鈣離子進(jìn)入胞質(zhì)，線粒體腫脹，影響到細(xì)胞色素氧化酶（COX），細(xì)胞色素釋放，啟動caspase凋亡系統(tǒng)，引起神經(jīng)元凋亡5。    目前臨床對AD的治療沒有較好

17、的藥物，開發(fā)抗AD藥物主要集中在通過研究AD發(fā)病的分子機(jī)制尋找新的靶點(diǎn)及抗氧化中藥的開發(fā)上。對黃芩的研究集中在其有效成分黃酮類化合物，趙淑敏等研究顯示總黃酮預(yù)處理能保護(hù)心肌抗氧化酶的活性，抵制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕自由基對心肌的損害；商亞珍等6研究顯示總黃酮通過影響AlCl3引起小鼠海馬組織MDA、SOD的變化減輕鋁中毒小鼠癡呆程度。因此黃芩莖葉總黃酮預(yù)處理可能通過減輕A引起的氧自由基的產(chǎn)生等機(jī)制而減輕A引起的損傷。黃芩莖葉總黃酮在抗炎、抗心肌缺血、腦缺血等疾病模型中已顯示出其保護(hù)作用，其在鋁中毒、A引起的癡呆中亦顯示出保護(hù)作用，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。   

18、 【參考文獻(xiàn)】  1 趙淑敏，劉 勝，楊宏光,等.黃芩莖葉總黃酮預(yù)處理對缺血再灌注心肌脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用J.解剖學(xué)雜志，2006，29（4）：450.    2 Zambrano A, Otth C, Mujica L, et al.Interleukin-3 prevents neuronal death induced by amyloid peptideJ.BMC Neurosci，2007,8:82.    3 Rodrigo Medeiros, Rui D.S. Prediger, Giselle F, et al. Connecting TNF- signaling pathways to iNOS expression in a mouse model of Alzheimer's disease: Relevance for the behavioral and synaptic deficits induced by amyloid proteinJ.The Journal of Neuroscience，2007,27(20):5394.