靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子A大鼠活體RNA干擾實(shí)驗(yàn)動物模型的建立

1、靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子A大鼠活體RNA干擾實(shí)驗(yàn)動物模型的建立         10-09-03 09:01:00     編輯：studa20                   作者：林恒唐春吳喬馮春林張玉君別平【摘要】  目的：在體外構(gòu)建并篩選出靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）的有效RNA干擾慢病毒

2、載體，用于大鼠整體RNAi實(shí)驗(yàn)，觀察其對肝組織中目的基因表達(dá)的干擾效果。方法：設(shè)計(jì)4條siRNA序列并合成雙鏈DNAoligo，制備目的基因RNA干擾慢病毒載體，體外感染目的細(xì)胞，利用RT-PCR和Western blot的方法檢測目的基因TFAM的表達(dá)情況，從而篩選出有效的干擾靶點(diǎn)。構(gòu)建大鼠活體RNAi動物模型，觀察大鼠肝臟中靶基因表達(dá)的變化情況。結(jié)果：酶切鑒定及測序結(jié)果均提示siRNA序列成功連接入載體中。RT-PCR結(jié)果提示3號靶點(diǎn)的干擾效率最高，達(dá)到了55左右，Western blot也驗(yàn)證了其干擾的有效性。大鼠活體RNAi結(jié)果顯示，肝臟中目的基因的表達(dá)也明顯減少，這種表達(dá)減弱具有特異

3、性和靶向性。結(jié)論：TFAM靶向RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建成功，能有效抑制目的細(xì)胞中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)。構(gòu)建的慢病毒載體在大鼠活體內(nèi)也具有良好的干擾效果。該研究為下一步利用此慢病毒載體進(jìn)行活體RNA干擾打下了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子A·RNA干擾·慢病毒載體·模型，動物·大鼠，Wistar【ABSTRACT】 Objective: To construct a recombinant lentivirus vector of RNA interference targeting mitochondrial transcripti

4、on factor A （TFAM） gene and to select the most efficient small interfering RNA （siRNA） to suppress TFAM in target cells, and  to use the selected lentivirus vector in vivo and to analyze its efficacy. Methods: According to Genbank information of TFAM, four siRNA and double strand DNA were desig

5、ned, synthesized and inserted into the lentivirus vector. The recombinant lentivirus vector system was confirmed by PCR and sequencing, then it was used to transfect the target cells. The change of TFAM expression was determined by PCR and Western blot. The most efficient lentivirus vector was selec

6、ted and used in vivo. The change of TFAM expression in liver was assessed. Results: The results of enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully. The result of RT-PCR showed that target 3#  had the highest interfering. Efficiency （abo

7、ut 55%） and Western blot analysis confirmed its efficacy. The result of RNAi in vivo also proved its efficiency. Conclusion: The recombinant lentivirus vector of RNA interference targeting TFAM has been successfully constructed. It can effectively suppress TFAM expression in vitro and in vivo.【KEY W

8、ORDS】 Mitochondrial transcription factor A·RNA interference·Lentiviral vector·Rats,wistarRNA干擾（RNA interference，RNAi）可用于生物學(xué)研究和藥物研制，并可作為疾病的一種治療手段。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些有治療作用的siRNA1，但siRNA如何有效地進(jìn)入體內(nèi)并傳遞到合適的靶器官和靶細(xì)胞尚不明確，文獻(xiàn)報(bào)道，用于活體內(nèi)傳遞siRNA的方法包括化學(xué)修飾形成共軛體（如脂質(zhì)體）2、與多肽、聚合物或抗體結(jié)合形成復(fù)合物3以及用病毒作為載體等。本研究設(shè)計(jì)合成靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（m

9、itochondrial transcription factor A，mtTFA，TFAM）的siRNA，并利用慢病毒載體系統(tǒng)將體外實(shí)驗(yàn)篩選出的有效siRNA通過門靜脈傳輸至大鼠肝臟，觀察其體內(nèi)的干擾活性，從而構(gòu)建出大鼠活體RNA干擾實(shí)驗(yàn)動物模型，為下一步實(shí)驗(yàn)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1材料與方法1.1動物來源及分組健康Wistar大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量180250 g。動物分為陽性病毒組（實(shí)驗(yàn)組）、陰性病毒對照組和生理鹽水對照組。1.2實(shí)驗(yàn)材料慢病毒包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株、大腸桿菌菌株DH5、及大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSCT6）均由上海吉凱基因技術(shù)有限公司提供；

10、慢病毒載體系統(tǒng)由pGCLV載體、pHelper1.0載體和pHelper2.0載體3種質(zhì)粒組成。Taq多聚酶購自日本Takara公司；LB培養(yǎng)基購自美國ATCC公司；大量質(zhì)粒DNA抽提試劑盒購自美國QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶Age、EcoR、T4 DNA連接酶及其緩沖液均購自美國NEB公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑均購自美國Promega公司；PCR用試劑、引物購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；胰酶購自上?；瘜W(xué)試劑公司；胎牛血清、DMEM、RPMI1640及OptiMEM均購自美國GIBCO公司；脂質(zhì)體Lipofect2000、總RNA提取試劑Trizol均購自美國Invi

11、trogen公司；山羊抗TFAM、小鼠抗GAPDH、抗山羊IgG、抗小鼠IgG均購自美國Santacruz公司；BCA Protein Assay kit購自美國HyClone-Pierce公司；ECL-PLUS/kit購自美國Amersham公司。1.3方法1.3.1構(gòu)建慢病毒載體針對目的基因TFAM的基因序列，利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了4個(gè)siRNA的寡核苷酸序列（命名為target1#、target2# 、target3# 和target4#，具體序列見表1），并進(jìn)行慢病毒載體的構(gòu)建（雙鏈DNA具體序列見表2），然后運(yùn)用T4連接酶與經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Age、EcoR雙

12、酶切后的pGCLV載體連接，用氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5，最后挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定并進(jìn)行測序分析。PCR鑒定陽性克隆的引物信息如下：上游引物：5-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，下游引物：5-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。1.3.2慢病毒載體包裝及滴度測定產(chǎn)毒細(xì)胞為293T細(xì)胞，將合成好的4個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒及輔助包裝載體質(zhì)粒進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，按照Lipofectamine2000使用說明共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液進(jìn)行濃縮和收獲，將病毒濃縮液移出，分

13、裝后保存在病毒管中，80 長期保存。取其中1支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測定，方法為孔稀釋法。具體病毒濃縮收獲及滴度測定實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)4。1.3.3慢病毒感染目的細(xì)胞HSCT6將處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為2×104），接種于12孔培養(yǎng)板中，37 、5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%；根據(jù)MOI值（MOI=10，MOI表示病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)量的比值），加入適宜量的病毒，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基；感染3 d后觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況，感染效

14、率>50%者繼續(xù)培養(yǎng)，待感染時(shí)間達(dá)到5 d后收集細(xì)胞抽提RNA進(jìn)行RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)，感染7 d后收集細(xì)胞并采用Western blot的方法檢測目的基因蛋白水平的表達(dá)；感染效率<50%的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組：CON為正常目的細(xì)胞，未感染任何病毒的細(xì)胞組，NC為正常目的細(xì)胞，加陰性對照病毒感染的細(xì)胞組，KD為正常目的細(xì)胞，加RNAi靶點(diǎn)病毒感染的細(xì)胞組，14標(biāo)示待篩選靶點(diǎn)病毒的序號。1.3.4目的細(xì)胞中TFAM RNAi效果檢測1.3.4.1RTPCR檢測目的細(xì)胞TFAM mRNA水平表達(dá)的變化情況取各組細(xì)胞用Trizol法抽提總RNA，然后根據(jù)Promega反

15、轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1L作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，TFAM上游引物：5-AGAAACGCCTAAAGAAGAAAGC-3，下游引物：5-TTCCAAGCCTGATTTACAAGC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物166 bp；內(nèi)參照actin上游引物：5-CGGCATTGTCACCAACTG-3，下游引物：5-CGCTCGGTCAGGATCTTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物約369 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 、15 s，之后每一步變性95 、5 s，退火延伸60 、30 s；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光度值。制作熔解曲線：PCR結(jié)束后，95 變性1 min，然后冷卻至55 ，使DN

16、A 雙鏈充分結(jié)合。從55 開始到95 ，每一步增加0.5 ，保持30 s, 同時(shí)讀取吸光度值。Real-time PCR數(shù)值分析采用2-Ct分析法。1.3.4.2Western blot檢測目的細(xì)胞TFAM蛋白水平表達(dá)的變化情況用2×Lysis Buffer（裂解液）冰上裂解細(xì)胞1015 min，裂解液配方如下：1 mol/L Tris-HCl（pH=6.8）100 mM、巰基乙醇 2、甘油20及SDS 4。測定蛋白濃度后，將每個(gè)樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2 g/L。各組取相同量總蛋白，采用SDS-PAGE電泳法電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5脫脂牛奶的TBST溶液封閉PVDF膜，山羊抗T

17、fam抗體（1200）、小鼠抗GAPDH抗體（15 000）與封閉好的PVDF膜室溫孵育2 h，TBST洗膜，相應(yīng)二抗（15 000）室溫孵育PVDF膜2 h，TBST洗膜，最后采用ECL法進(jìn)行顯色。利用圖像處理軟件Quantity one4.62對蛋白電泳圖片進(jìn)行分析，分別測定目的蛋白條帶和內(nèi)參照的吸光度值，并以二者的比值作為目的蛋白的相對定量結(jié)果。1.3.5大鼠活體RNAi動物模型的建立擬通過門靜脈將慢病毒載體注入大鼠肝臟，為了保證慢病毒在大鼠體內(nèi)的感染效率，我們在注射慢病毒之前進(jìn)行了全肝血流阻斷并參考文獻(xiàn)5的做法將阻斷時(shí)間定為20 min。具體方法如下：1）實(shí)驗(yàn)組大鼠腹部用8Na2S脫毛，手術(shù)野用碘伏消毒，整個(gè)手術(shù)過程在雙人雙目顯微鏡下操作。進(jìn)行全肝血流阻斷時(shí)，先結(jié)扎右腎上腺靜脈，然后依次阻斷肝后下腔靜脈、肝動脈和門靜脈的血流，全肝血流阻斷后立即通過門靜脈注射RNA干擾慢病毒載體（5×107 TU/只），阻斷20 min后恢復(fù)血流。2）陰性病毒對照組和生理鹽水對照組手術(shù)步驟基本上和實(shí)驗(yàn)組相同，不同的是門靜脈分別注射的是陰性對照病毒和生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前禁食12 h，麻醉采用乙醚吸入麻醉，術(shù)后自由進(jìn)食水。各組觀察時(shí)相點(diǎn)為術(shù)后4、7、14 d，保證每時(shí)相點(diǎn)每組存活