酶法提取仙人草黃酮類化合物的研究

1、酶法提取仙人草黃酮類化合物的研究    【摘要】  目的研究纖維素酶對(duì)仙人草黃酮提取得率的影響。方法采用纖維素酶酶解預(yù)處理合用乙醇水浴加熱回流從仙人草中提取總黃酮，以仙人草黃酮類化合物的提取率為指標(biāo)，考察提取過程中各因素對(duì)得率的影響。結(jié)果最佳酶解條件為：酶解溫度50;酶解時(shí)間2.5 h，酶解pH值4.5;酶濃度10 U/ml;酶法輔助提取仙人草黃酮平均得率為1.301%，比傳統(tǒng)提取方法提高了9.79%。結(jié)論纖維素酶輔助有利于提高仙人草黃酮提取得率。 【關(guān)鍵詞】  酶法; 仙人草; 提取; 黃酮類化合物仙人草Mesona chinens

2、is Benth.,又名涼粉草、仙人凍、仙草,為唇形科一年生草本植物。分布于廣東、廣西、江西、福建、浙江、臺(tái)灣和云南等地，印度、印度尼西亞和馬來(lái)西亞等地也有分布1。我國(guó)南方幾個(gè)省區(qū)部分地方有田間栽培。據(jù)本草求原記載，涼粉草有“清暑熱，解熱毒,治酒風(fēng)”的功效，又據(jù)嶺南采藥錄中記載，涼粉草可治花柳毒入骨。中醫(yī)認(rèn)為，涼粉草性涼寒，味甘淡澀，嚼之有膠性，具有清熱利濕、涼血解暑，解渴利水和除熱毒之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析測(cè)定認(rèn)為，涼粉草中的黃酮類物質(zhì)、熊果酸、齊墩果酸、多糖、微量元素、維生素等各自具備調(diào)節(jié)和增強(qiáng)生理機(jī)能的作用24。臨床上涼粉草可治中暑、消渴、高血壓病、黃疸、急性腎炎、酒風(fēng)、淋病等癥。仙人草作為

3、中草藥和制作涼粉凍的原料在我國(guó)已有悠久的歷史，并且已經(jīng)成了我國(guó)南方一些地方的出口創(chuàng)匯的農(nóng)產(chǎn)品。涼粉草有效成分的提取有助于涼粉草進(jìn)一步開發(fā)利用，目前研究較多1, 5，6，但仙人草中的成分被以纖維素為主構(gòu)成的細(xì)胞壁所包圍，影響得率。有研究表明酶法輔助可提高植物中有效成分的提取率712。本實(shí)驗(yàn)以黃酮類化合物提取率為考察指標(biāo)，研究酶法輔助提取對(duì)仙人草有效成分得率的影響。1 材料仙人草，購(gòu)買于梅州市梅松路益民百草店，已曬干;纖維素酶，上海伯奧生物科技有限公司，酶活力15 U/mg;蘆丁，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蘆丁含量>95.0%;95%食用乙醇;硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。2 方法2

4、.1 仙人草材料的處理將仙人草放于干燥箱中60干燥，用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀。2.2 仙人草黃酮類化合物的提取傳統(tǒng)的乙醇加熱提取方法：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱量1 g仙人草，用80%乙醇，料液比140(g/ml)，70恒溫水浴回流加熱提取3 h，回流后過濾，得濾液,將濾液定容至40ml。酶解輔助提取方法：稱量1 g仙人草，置于纖維素酶液中，料液比15( g/ml)，使其在一定的酶解條件下反應(yīng)一定時(shí)間;酶解完成后，蒸干酶液，用80%乙醇,料液比140,70恒溫水浴回流加熱提取3 h;回流后過濾，得濾液，將濾液定容至40 ml。實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值。2.3 黃酮類化合物含量測(cè)定采用NaNO2-Al(

5、NO3)3-NaOH顯色法12，以蘆丁為標(biāo)樣測(cè)定仙人草總黃酮含量。用50%乙醇配得濃度為0.102 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，分別置于25 ml容量瓶中，各加50% 乙醇使成15.0 ml，各精密加入5% NaNO2溶液0.3 ml，充分搖勻，放置6 min;精密加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，充分搖勻，放置6 min;再加1 mol/L NaOH溶液4.0ml，用50% 乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，放置15 min。以50?乙醇作為空白參比液，用分光光度法，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度A，得到回歸曲線方程：C=

6、0.0621A+0.000 3，R2=0.999 5(式中：C，樣品的濃度mg/ml;A，吸光度)。準(zhǔn)確吸取2 ml提取液替代標(biāo)準(zhǔn)液，按上法提取液的吸光度A，計(jì)算樣品中的黃酮提取率Q。2.4 最佳酶解條件的確定單因素試驗(yàn)以A(酶解溫度)、B(酶解初始pH值)、C(酶解時(shí)間)、D(酶濃度)為4個(gè)考察因素。正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇采用L16(45)正交表，因素水平表見表1。表1 因素水平3 結(jié)果與討論3.1 酶解條件對(duì)仙人草總黃酮提取得率的影響纖維素酶作用于仙人草細(xì)胞，使構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素降解為二聚糖、葡萄糖等小分子物質(zhì)，細(xì)胞壁的破裂有利于仙人草黃酮的浸出。各種酶均有最適作用條件，實(shí)驗(yàn)考察了

7、酶濃度、酶解溫度、酶解pH值、酶解時(shí)間對(duì)仙人草總黃酮提取得率的影響。酶解溫度50，酶解pH值4.5，酶解時(shí)間2.5 h，以不同的酶濃度處理。結(jié)果見圖1。在酶濃度為10 U/ml以下，總黃酮收率隨酶濃度的增大而增加，當(dāng)酶濃度為10 U/ml時(shí)，黃酮類化合物的得率為最大值，繼續(xù)增大酶濃度，提取得率變化不明顯。溫度升高一般有利于提取。由于酶的活性多在4050較好，因此考察酶解溫度為40，45，50，55，60對(duì)仙人草黃酮類化合物最終提取得率的影響。酶濃度10 U/ml，酶解pH值4.5，酶解時(shí)間2.5 h，以不同的酶解溫度進(jìn)行提取。結(jié)果見圖2。酶最適作用溫度為50，此時(shí)最有利于細(xì)胞壁分解，使黃酮類化

8、合物更易向溶劑主體的擴(kuò)散，提高仙人草總黃酮的提取率，以后隨酶解溫度的進(jìn)一步升高酶活下降導(dǎo)致得率減少。圖1 酶濃度與仙人草黃酮類 圖2 酶解溫度和黃酮類化合物提取得率的關(guān)系 化合物提取得率的關(guān)系在酶濃度10 U/ml，酶解pH值4.5，酶解溫度50，以不同的酶解時(shí)間進(jìn)行提取。結(jié)果見圖3?？梢娒附鈺r(shí)間的長(zhǎng)短也將影響酶解效率，時(shí)間太短，破壁效果不佳，時(shí)間太長(zhǎng)一方面將給工作帶來(lái)一定的困難，而且過長(zhǎng)的酶解時(shí)間并不能繼續(xù)提高提取得率，酶解3 h即可達(dá)到最佳效果。纖維素酶的活性與pH值密切相關(guān)，pH值不僅能夠影響酶的構(gòu)象，也能影響底物的解離狀態(tài)，從而對(duì)酶活力產(chǎn)生影響。纖維素酶的活性在微酸性環(huán)境下較好，所以設(shè)

9、計(jì)pH值分別為4，4.5，5，5.5，6五個(gè)pH值水平的實(shí)驗(yàn)，考察pH值對(duì)黃酮類化合物得率的影響。酶解溫度50，酶濃度10 U/ml，酶解時(shí)間2.5 h，不同的酶解pH值進(jìn)行提取，結(jié)果見圖4，最適pH=4.5。圖3 酶解時(shí)間和黃酮類 圖4 酶解pH值和黃酮類化合物提取得率的關(guān)系 化合物提取得率的關(guān)系3.2 最適酶解條件的確定由表3可知，最佳酶解條件為酶濃度10 U/mL，酶解溫度50，酶解pH值4.5，酶解時(shí)間2.5 h，此酶解條件為最優(yōu)組合。方差分析表明，因素A(酶解溫度)、因素C(酶解時(shí)間)高度顯著，因素D(酶濃度)較顯著，因素B(酶解pH值)不顯著。表3 L16(45)正交結(jié)果表4 方差

10、分析表3.3 加酶提取與傳統(tǒng)提取方法的比較從表5可知，加酶處理提取(1組)比未加酶處理提取得率分別提高了9.79%(2組)和9.604%(3組)，酶法輔助提取效果較明顯。表5 3種提取方法的結(jié)果比較4 結(jié)論酶解輔助提取過程分為酶解和乙醇加熱回流提取兩部分，對(duì)酶解過程的影響因素，如酶濃度，酶解溫度，酶解pH值，酶解時(shí)間逐一考察，并進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)以確定最佳酶解條件的組合。在最佳酶解條件下酶解輔助提取與傳統(tǒng)乙醇回流提取進(jìn)行比較，比較兩者的提取得率。本實(shí)驗(yàn)建立酶解法與醇提相結(jié)合的提取方法，確定了最佳酶解條件為酶濃度10 U/ml，酶解溫度50，酶解pH值4.5，酶解時(shí)間2.5 h，獲得了較好的效果，用酶

11、解預(yù)處理后，再用乙醇提取，仙人草黃酮類化合物的得率比直接醇提提高了9.79%，能夠有效利用仙人草資源。酶法輔助提取方法用于中草藥的提取，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，并具備大生產(chǎn)的可行性。目前，應(yīng)加強(qiáng)酶處理技術(shù)應(yīng)用于中草藥工業(yè)生產(chǎn)的研究，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 劉曉庚，陳梅梅. 中國(guó)仙草的開發(fā)利用研究J. 食品研究與開發(fā)， 2004， 25(5): 109.2 楊 敏，馮 磊，柯雪琴，等. 仙草多糖對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的實(shí)驗(yàn)研究J.浙江預(yù)防科學(xué)， 2002， 14(12):4.3 李建華. 臺(tái)灣仙草及其栽培利用J. 臺(tái)灣農(nóng)業(yè)探索， 2000， 12: 37.4 柳占彪，王 鼎，王淑珍，等. 齊墩果酸的降糖作用J. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 1994， 29(12):725.5 吳小林， 戴 敏， 關(guān)衛(wèi)兵，等.仙草中提取仙草膠及其膠性能測(cè)定J. 中藥材， 2008， 31(9): 1421.6 尹懷霞， 黎錫流， 朱良從. 仙草中提取仙草膠的研究J. 現(xiàn)代食品科技，2006， 22(3):134.7 何際嬋.淺談酶法在中草藥提取中的應(yīng)用J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23(9):1717.8 陳炳華，張其清，謝必峰，等.酶解法對(duì)山楂總黃酮提取及含量分析的影響J.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1997，13(4):90.9 叢 偉.酶法提取銀杏葉