聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析家蠅抗性基因的研究

1、    聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析家蠅抗性基因的研究*        摘要目的：家蠅對(duì)擬除蟲菊酯抗藥性與細(xì)胞色素 P450的CYP6D1基因有關(guān)，采用分子生物學(xué)的特異性基因聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析家蠅抗藥性的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，探討早期預(yù)測(cè)及防治策略。方法：提取雄性家蠅腹部DNA作為反應(yīng)模板，根據(jù)CYP6D1基因序列設(shè)計(jì)特異性基因引物，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物與生物測(cè)試結(jié)果比較。結(jié)果：D-R品系擴(kuò)增陽(yáng)性率100%，敏感品系擴(kuò)增陽(yáng)性率為0，深圳、汕頭、韶關(guān)、廣州、茂名品系擴(kuò)增陽(yáng)性

2、率分別為59%、56.3%、54%、55%及25%。擴(kuò)增陽(yáng)性率與家蠅對(duì)擬除蟲菊酯抗性倍數(shù)呈正相關(guān)(r0.8344，P0.05)。結(jié)論：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用于家蠅抗性發(fā)生、發(fā)展規(guī)律分析，早期診斷及抗藥性發(fā)生機(jī)理研究有重要意義。關(guān)鍵詞聚合酶鏈反應(yīng)細(xì)胞色素 P450抗藥性基因家蠅 Study on a Polymerase Chain Reaction (PCR) Analysing the Insecticide Resistance in the Housefly,Musca domesticaLin LifengZhang ZihongLiu Liping(Health and Anti-Ep

3、idemic Station of Guangdong Province,Guangzhou,510300 )AbstractA cytochrome P450 is responsible for pyrethroid resistance in the housefly. A PCR was used for measuring the relativity between the amplificative frequency of specific resistant alleles in Musca domestica and the pyrethroid resistance ra

4、tio. The results showed that the positive rate of amplification of specific resistant alleles were 100%,0,59%,56.3%,54%,55% and 25% in the deltamethrin resistant strain, susceptible strain, Shenzhen,Shantou,Shaoguan,Guangzhou,Maoming strains respectively. There was positive relativity between the am

5、plificative frequency of individual housefly and resistance ratio to deltamethrin.Key wordsPolymerase chain reactionCytochrome P450ResistanceGeneHousefly掌握衛(wèi)生害蟲自然群體中抗性水平對(duì)預(yù)測(cè)抗性發(fā)展、制訂控制措施有重要意義?？剐詼y(cè)定常用生物測(cè)定法，從整體水平測(cè)定抗藥性，廣為應(yīng)用的也有生化方法測(cè)定酶活性、分子生物學(xué)方法測(cè)定抗性基因分析抗藥性發(fā)展趨勢(shì)等1-2。家蠅對(duì)擬除蟲菊酯抗藥性與細(xì)胞色素P450單氧化酶有關(guān)，特別是與P450的特異基因CYP6D

6、1變異有關(guān)3。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)廣東省家蠅特異抗性基因出現(xiàn)頻率，從分子生物學(xué)水平探討分析家蠅抗藥性的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。1材料與方法1.1家蠅來(lái)源抗溴氰菊酯品系(D-R)家蠅、敏感品系(S)家蠅，均為本站昆蟲室培養(yǎng)品系；還有深圳、茂名、韶關(guān)、廣州及汕頭品系(SZ、MM、SG、GZ及ST)家蠅。同批家蠅雌蟲用于生物測(cè)定，雄蟲用液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?.2生物測(cè)定自動(dòng)微量點(diǎn)滴法4。1.3特異抗性基因的聚合酶鏈反應(yīng)(SPCR)1.3.1家蠅DNA模板制備參照基因公司的QIAamp組織試劑盒提純DNA方法5：(1)家蠅組織溶解：取液氮保存的雄蠅腹部置于1.5ml離心管，加180l AT

7、L液勻漿，再加20l蛋白酶K，搖勻，55培養(yǎng)至組織溶解，加入20l RNaseA(20g/l)室溫培養(yǎng)2min，加200l AL緩沖液，70培養(yǎng)10min；(2)DNA固定結(jié)合：加210l 98%酒精到上述培養(yǎng)液，混勻后加到QIAamp管(置于2ml收集管內(nèi))，8 000rpm離心1min；(3)沖洗：用500l Aw緩沖液沖洗QIAamp管2次；(4)DNA洗出：將70預(yù)熱的200l AE緩沖液加入QIAamp管(置于2ml收集管內(nèi))，70培養(yǎng)5min，8 000rpm離心1min，連續(xù)沖洗2次。洗出液為DNA模板，保存?zhèn)溆谩?.3.2PCR反應(yīng)(1)引物設(shè)計(jì)參照N.Liu和T.Tomita

8、6根據(jù)抗擬除蟲菊酯家蠅的CYP6D1基因序列設(shè)計(jì)的3個(gè)引物，委托上海生工生物工程公司合成。引物1：5-CACAAAATGACCGGCAACTA-3非特異性基因；引物2：5-ACATTGTCGACTTCTTTGGG-3；引物3：5-ACGGCCATTTGGCCTGGTTA-3特異性基因。引物1，2所含的序列為830bp，引物2，3所含的序列為580bp，使用前配成10pmol/l。(2)擴(kuò)增在0.5ml Eppendoff管中終濃度為10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2m引物1和2或引物2和3，0.2mM的各種dNTP及1.5U的Taq聚合酶(上

9、海生工產(chǎn)品)。加入3l DNA模板，加雙蒸去離子水至終體積為25l?；靹蚝蠹尤?0l石蠟油，離心10s，分層。在基因擴(kuò)增儀(PE480，美國(guó))自動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95預(yù)變性2min，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：95×45s、55×45s、67×45s、72×45s，最后一個(gè)循環(huán)72延伸7min。1.3.3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及檢查取10l擴(kuò)增產(chǎn)物加2l 6倍加樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水)，加到2%瓊脂糖凝膠(含0.5g/ml的溴化乙錠)電泳，并加入Bio-Rad低分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA(上海生工提供)對(duì)照，電泳結(jié)果在紫外光燈檢測(cè)并攝影。

10、2結(jié)果2.1家蠅對(duì)溴氰菊酯的抗藥性結(jié)果見(jiàn)表1。表1家蠅對(duì)溴氰菊酯的抗藥性種群檢查蟲數(shù)(只)LD50(g/蟲)RRS480 0.00201D-R4802.0001000.00MM4800.01115.55GZ4800.01527.60SG4800.01849.22ST4800.021510.80SZ4800.034617.302.2家蠅CYP6D1基因的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2及14。 1S品系家蠅基因PCR擴(kuò)增結(jié)果a、e、b、f、c、g、d、h分別是同一家蠅各用引物1/2及2/3擴(kuò)增結(jié)果；M：Bio-Rad低分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA；下同2D-R品系家蠅基因PCR擴(kuò)增結(jié)果3茂名品系家蠅基因PCR擴(kuò)增結(jié)果4深圳品

11、系家蠅基因PCR擴(kuò)增結(jié)果表2家蠅CYP6D1基因的擴(kuò)增結(jié)果種群非特異性基因抗性特異性基因檢查只數(shù)陽(yáng)性只數(shù)陽(yáng)性率(%)檢查只數(shù)陽(yáng)性只數(shù)陽(yáng)性率(%)S201050.02000.0D-R302583.33030100.0MM24937.524625.0GZ201785.0201155.0SG241875.0241354.0ST322681.3321856.3SZ342882.4342059.0茂名種群特異性基因的擴(kuò)增陽(yáng)性率比廣州、韶關(guān)、汕頭、深圳種群的低(23.84，P0.05)，廣州、韶關(guān)、汕頭、深圳種群的擴(kuò)增陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性(23.84，P0.05)。特異性基因的擴(kuò)增比非特異性基因強(qiáng)(14)。

12、2.3家蠅抗性與PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率的關(guān)系見(jiàn)表3。 表3家蠅抗性與PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率的關(guān)系種群對(duì)溴氰菊酯的抗性倍數(shù)特異性基因陽(yáng)性率(%)非特異性基因陽(yáng)性率(%)S1.000.050.0MM5.5525.037.5GZ7.6055.085.0SG9.2254.075.0ST10.856.381.3SZ17.359.082.43討論 家蠅CYP6D1基因位于第1染色體6，當(dāng)家蠅對(duì)擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性，在cDNA第270點(diǎn)位的核苷酸T變?yōu)锳3，根據(jù)這一特點(diǎn)，將變異點(diǎn)作3-末端設(shè)計(jì)引物2、3(含580bp)的特異性抗性基因，另用非特異性基因含830bp為對(duì)照比較。結(jié)果：特異性抗性基因引物產(chǎn)生的擴(kuò)增特異性強(qiáng)，抗

13、溴氰菊酯品系，擴(kuò)增陽(yáng)性率達(dá)100%。敏感品系家蠅由于不存在抗性基因，因此沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增。非特異性基因引物(1、3)擴(kuò)增的陽(yáng)性率差異不大。抗性倍數(shù)與特異性基因陽(yáng)性率(%)的相關(guān)性檢驗(yàn)：r0.8344(v4)，呈顯著正相關(guān)(P0.05)抗性倍數(shù)與非特異性基因陽(yáng)性率(%)的相關(guān)性檢驗(yàn)：r0.6854(v4)，無(wú)相關(guān)性(P0.05)本技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，深圳、汕頭、韶關(guān)、廣州、茂名株的特異性基因擴(kuò)增陽(yáng)性率隨著其敏感性的增高而下降，與對(duì)菊酯類的抗性倍數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，r0.8344(P0.05)。非特異性基因的擴(kuò)增陽(yáng)性率與抗性倍數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性，r0.6854(P0.05)，說(shuō)明特異性基因的PCR監(jiān)測(cè)能從分子

14、學(xué)水平檢測(cè)蠅類抗性水平。本研究發(fā)現(xiàn)家蠅的抗性基因出現(xiàn)頻率大于50%時(shí)，家蠅已產(chǎn)生明顯的抗藥性。當(dāng)擴(kuò)增陽(yáng)性率為25%、抗性倍數(shù)是5.5倍時(shí)，應(yīng)用PCR技術(shù)能有效、早期發(fā)現(xiàn)家蠅抗性發(fā)生。非特異性基因引物1，2擴(kuò)增陽(yáng)性率理論應(yīng)該是100%，但可能由于合成片段(含830bp)比特異性基因擴(kuò)增片段(含580bp)較長(zhǎng)，不易合成的緣故，所以擴(kuò)增結(jié)果明顯較弱，此現(xiàn)象與張玲敏的研究結(jié)果相似7。特異基因PCR技術(shù)應(yīng)用，可進(jìn)一步通過(guò)研究，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)家蠅，觀察第幾代次施藥后家蠅出現(xiàn)特異性抗性基因、抗性基因的發(fā)生頻率以及停藥后培養(yǎng)幾代抗性基因頻率出現(xiàn)下降，甚至消失；亦可通過(guò)交替用藥或混配施藥方法培養(yǎng)家蠅抗藥性，研究

15、交替用藥的頻度，可以延緩抗性基因產(chǎn)生，這對(duì)指導(dǎo)蠅類以及衛(wèi)生害蟲防制、合理用藥具有現(xiàn)實(shí)意義。已發(fā)現(xiàn)家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性與細(xì)胞色素P450單加氧化酶的多個(gè)基因有關(guān)，其中CYP6D1是一重要的控制基因。本研究發(fā)現(xiàn)該基因突變頻率與抗藥性密切相關(guān)。通過(guò)PCR技術(shù)，分析各有關(guān)的抗性基因在家蠅產(chǎn)生抗性中所處的地位，對(duì)于了解抗性發(fā)生機(jī)制及對(duì)于抗性從分子學(xué)水平治理有深遠(yuǎn)意義。(本課題承蒙中科院動(dòng)物研究所馮國(guó)蕾研究員等指導(dǎo)及本站流研所、寄研所的支持，一并致謝)* 廣東省重大科研項(xiàng)目基金及醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助課題作者單位：廣東省衛(wèi)生防疫站(廣州 510300)參考文獻(xiàn)1李月明，孫耘芹，龔坤元，等.乙酰膽堿酯酶敏感性的變化與家蠅抗藥性的關(guān)系.昆蟲學(xué)報(bào)，1987，30(3)139-245.2Dmitri Ardreev.A PCR Diagnostic for Cyclodiene Inseticide Resistance in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum. Pestic.sci,1994,41345-349.3Tomlta T and Scott JG.Insect Biochem.Molec.Biol.,1994.4張紫