南方醫(yī)科大學(xué)分生實(shí)驗(yàn)綠色熒光蛋白EGFP的基因克隆

1、綠色熒光蛋白（EGFP）的基因克隆南方醫(yī)科大學(xué) 學(xué)院 摘 要 本實(shí)驗(yàn)旨在學(xué)習(xí)基因克隆并檢驗(yàn)，綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后很穩(wěn)定，對(duì)多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報(bào)道基因，便于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過將含有目的基因GFP的pEGFP-N1質(zhì)粒和pMD18-T載體進(jìn)行酶切、電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)入、篩選之后，把GFP基因成功導(dǎo)入到大腸桿菌DH5 (克隆菌)中，從而實(shí)現(xiàn)熒光蛋白基因的克隆和表達(dá)。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白 克隆 表達(dá)實(shí)驗(yàn)名稱綠色熒光蛋白的基因克隆實(shí)驗(yàn)日期2015- 2015-實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)合作者指導(dǎo)老師評(píng)分教師簽名批改日期一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行DNA酶切的原理和方法。2. 學(xué)習(xí)掌

2、握瓊脂糖凝膠電泳的基本原理和操作方法。3. 掌握PCR技術(shù)原理和PCR儀的操作方法。4. 學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物的TA克隆的基本原理和操作步驟。5. 了解和掌握大腸桿菌的制備方法的基本原理和操作要點(diǎn)以及DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原理和方法。6. 掌握雙酶切法鑒定重組DNA的基本原理和操作步驟，以及菌落PCR鑒定重組DNA的基本原理和方法。7. 掌握IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)的基本原理和操作步驟二、 實(shí)驗(yàn)原理1. pEGFP-N1質(zhì)粒2. T載體三、 材料與方法：1. 實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒：pEGFP-N1T載體：pUCm-T菌種：DH5a(克隆菌)PCR引物：FGGCATATGGTGAGCAAGGGCGARCGG

3、GATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56實(shí)驗(yàn)試劑：即用型藍(lán)白T載體（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA連接試劑盒限制性內(nèi)切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen質(zhì)粒提取試劑盒抗生素：氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，大容量冷凍離心機(jī)，PCR儀，紫外分光光度計(jì)，水平電泳槽，垂直電泳槽，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，制冰機(jī)、超低溫冰箱等2. 方法分離目的基因限制酶切割目的基因與載體連接重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩選重組體、轉(zhuǎn)化子四、 實(shí)驗(yàn)具體流程1. 獲取外源基因

4、1) 堿裂解法提取質(zhì)粒使用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒徹底棄上清棄上清菌液離心1300r pm,1min瞬時(shí)離心加350l 溶液S3加250l 溶液S2加250l 溶液S1漩渦震蕩顛倒數(shù)次懸浮沉淀取上清600l加到吸附柱中離心13000rpm,10min 顛倒數(shù)次離心 放置3-5min13000rpm,1min棄濾液，加入600l洗滌液W棄濾液，加入600l洗滌液W離心 離心放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加40l洗脫液13000rpm,1min 13000rpm,1minPCR擴(kuò)增 / -20保存?zhèn)溆脳墳V液空柱離心離心13000rpm,2min13000rpm,1min2) PCR擴(kuò)增目

5、的基因GFP取0.2 ml PCR反應(yīng)管一支，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑(注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭)：H2O6ml質(zhì)粒DNA（pEGFP-N1）2ml引物GFP1 (10mM)1ml引物GFP2 (10mM)1mlPremix Taq10ml總體積20ml加完試劑后，將PCR反應(yīng)管放到PCR儀上。PCE參數(shù)設(shè)置： 94預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán) 94 30 秒 56 30 秒 30 循環(huán) 72 1 分鐘 72 7 分鐘 4 保溫3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的質(zhì)粒凝膠準(zhǔn)備膠床準(zhǔn)備鋪膠靜置膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣（1mlPCR產(chǎn)物，6ml loading buffer

6、混合點(diǎn)樣）點(diǎn)marker電泳取出凝膠拍照2. 構(gòu)建重組DNA使用即用型藍(lán)白T載體和快速DNA連接試劑盒。按下表加入試劑：為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化是否成功，設(shè)置對(duì)照組實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組即用型藍(lán)白T載體1 ml1 mlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 mlControl Insert DNA1 ml快速連接緩沖液(2X)5 ml5 ml超純水-ddH2O2.5 ml2.5 mlRapid T4 DNA ligase0.5 ml0.5 ml總體積10 ml10 ml添加完成后，冰箱內(nèi)16反應(yīng)45分鐘3. 重組DNA的轉(zhuǎn)化1) 預(yù)先制備好感受態(tài)細(xì)胞。2) 轉(zhuǎn)化DNA，為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化是否成功，設(shè)置對(duì)照組實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組：10ml PCR產(chǎn)物

7、/藍(lán)白T載體連接產(chǎn)物+ 100ml感受態(tài)細(xì)胞陽性對(duì)照組：10ml Control Insert DNA/藍(lán)白T載體連接產(chǎn)物+100ml感受態(tài)細(xì)胞陰性對(duì)照組：10ml無菌雙蒸水 + 100ml感受態(tài)細(xì)胞步驟：（分別制作3組）將10mlDNA和100ml的感受態(tài)細(xì)胞加入試管中冰浴30min42水浴精確90s迅速轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻1-2min加入800mlLB培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)45min3) 檢測(cè)重組DNA：涂布平板篩選步驟：取適量體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素（Amp、X-gal、IPTG）的LB固體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置幾分鐘，倒置平皿37培養(yǎng)過夜。4. 重組DNA的

8、篩選培養(yǎng)的菌落在篩選培養(yǎng)基中，白色的菌落含有重組體pUC18，藍(lán)色菌落則沒有或只有載體pUC18。挑選白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)：用接種棒在白色單菌落上挑取菌落，接種于4mlLB/Amp+培養(yǎng)液中，37震蕩培養(yǎng)過夜。5. 重組DNA的鑒定從擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液中提取重組質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)行瓊脂糖凝膠水平電泳。進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。劇烈震蕩菌體沉淀擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液步驟：12000rpm 250ml250ml取600ml上清于吸附柱管1min 溶液S1裂解液S2 顛倒混勻4-6次350ml溫和的顛倒混勻6-8次12000rmp 室溫靜置35min中和液S3直到出現(xiàn)白色絮狀沉淀10min棄濾液空柱棄濾液

9、棄濾液 12000rmp600ml洗滌液W600ml洗滌液W30s12000rpm 30s12000rpm 30s收集洗脫液備用取吸附柱至另一新EP管 10000rpm50ml 室溫靜置 12000rpm2 min洗脫液1min1min潔凈離心管2ml10× Buffer R10mLH2O6ml取5ml加1mlloading buffer混合取5ml，加1mlloading buffer混合混合后37水浴116h 2mlEcoR I電泳五、結(jié)果與討論： 最后插入質(zhì)粒中的DNA片段應(yīng)為740bp，重組質(zhì)粒大小應(yīng)為3038bp+740bp=3778bp實(shí)驗(yàn)結(jié)果現(xiàn)象與討論堿裂法提取質(zhì)粒50

10、00pEGFP-N1質(zhì)粒大小為4.7kb，電泳顯示光帶與marker5k相近，說明質(zhì)粒提取較成功。電泳顯示出兩條帶，可能原因：1、 加入S2時(shí)顛倒力度過大造成DNA斷裂。2、 加入S2變形時(shí)間過長。3、 加入S3復(fù)性時(shí)間過長。4、 提取的質(zhì)粒不夠純凈。PCR擴(kuò)增目的基因7502000只出現(xiàn)兩條帶，其中有接近750bp的光帶，說明目的基因在PCR擴(kuò)增中得到擴(kuò)增。重組DNA的篩選12111111111實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中：1是藍(lán)色菌落2是白色菌落陽性對(duì)照組培養(yǎng)基中只有白色菌落陰性對(duì)照組培養(yǎng)基中無菌落說明重組DNA較為成功。5000重組DNA的鑒定2000121是酶切DNA2是提取的質(zhì)粒DNA當(dāng)天實(shí)驗(yàn)使用的marker為2000bp。5000兩個(gè)光帶均亮度微弱，且均大于2000bp，酶切DNA沒有出現(xiàn)740bp的光帶。 111總結(jié)：在PCR擴(kuò)增中，雖然有接近750bp的光帶，但亮度微弱，說明在實(shí)驗(yàn)過程中，DNA破壞嚴(yán)重，所以到后面實(shí)驗(yàn)中，重組成功的細(xì)菌，量不多，光帶亮度