ABI_7300的使用維護(hù)及校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、ABI 730 0 的 使 用 維 護(hù) 及 校 準(zhǔn) 標(biāo) 準(zhǔn) 操 作 程 序1、目 的： ABI PRISM 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀能夠正確和正常的使用，保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。2、適用范圍：ABI PRISM 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀。3、操作人：段建平蔡果4、操作程序4.1 操作方法4.1 開機(jī)順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量 PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開ABI7300 系統(tǒng)軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.2 創(chuàng)建熒光定量PCR 檢測文件：4.2.1 雙擊7300 System Software軟件圖標(biāo)。從File菜單中選擇New （或單擊工具欄中的“新建

2、 ”按扭）4.2.2 在 New Document窗口中，Assay項選擇 “Absolute Quantification（Standard Curve） ”，選擇 “完成 ”，就會出現(xiàn)一個96 孔的空白面板。4.2.3 雙擊此空白面板中的任一方格，就會彈出“ Well Inspector 。 ”4.2.4 在 “Well InspectoiWfW擊 “Add Detect。就會彈出 “detector manager ' 窗口。4.2.5 點(diǎn)擊 “Fild New.；就會彈出 “new detecto菜單4.2.6 在“new detecto窗已進(jìn)行樣本信息輸入：1）在“Nam和以

3、輸入：按自己的喜好輸入易于區(qū)分的name2）在“Reporter Dy選擇所用試劑探針?biāo)捎玫膱蟾婊鶊F(tuán)如：FAM3）在“Quencher Dye選擇所用試劑探針?biāo)捎玫膱蟾婊鶊F(tuán)如：TAMRA4）在“Colo成:擊右邊顏色小方格后可以按自己的喜好選擇顏色。5）設(shè)置好之后點(diǎn)擊 OK會回到“detector manager窗白4.2.7 在 “detector manager® 白依次點(diǎn)擊 “Add To Plate Document、”“Don西4.2.8 完成了 Detector的設(shè)置；會重新回到“Well Inspecto課單請做如下設(shè)置：1） 在 “Passive Referenc

4、e折"None；2）在“UseF的小方框中打勾；3）在“Sample NameH!殳在參考標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔中習(xí)慣性的輸入：試劑批次號如： HBV2006018。設(shè)置好之后關(guān)閉“Well Inspectors。4.3 設(shè)置循環(huán)條件:4.3.1 在Plate面板中選中“Instrument通過面板上的 “Add Cycle ” “Add Step'： "Data Collection等按鈕，參照試劑說明書設(shè)置好“Instrument面板。4.3.2 選才? File （文件）> Save As （另存為），為絕對定量反應(yīng)板文件 輸入一個文件名，然后單擊 Save （保

5、存）。4.4 推開滑門，按照面板設(shè)置放好自己的試驗(yàn)樣品，關(guān)閉倉門。4.5 按下Start開始PCR實(shí)驗(yàn)。在儀器運(yùn)行PCR程序期間，Instrument （儀 器）選項卡上會顯示實(shí)時狀態(tài)信息，并報告熒光信號強(qiáng)度。程序運(yùn)行結(jié)束后，狀態(tài)值和按鈕變?yōu)榛疑?Analysis （分析）按鈕（）變?yōu)榭?用狀態(tài)，并顯示信息提示您程序是否成功運(yùn)行。程序運(yùn)行期間生成的所有數(shù)據(jù)都保存到步驟4.2.3中指定的絕對定量反應(yīng)板文件中。4.6 在反應(yīng)結(jié)束后按Save鍵儲存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源開關(guān)。4.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。4.7.1 試驗(yàn)結(jié)束，為保險起見，可再次保存試驗(yàn)結(jié)果到指定目錄，然后打開試 驗(yàn)結(jié)果*.sds文件

6、4.7.2 點(diǎn)擊 “results 有 “ PlateSpectra Component Amplification Plot > Standard Curve、Dissociation、Dissociation、Report ” 個子目錄。4.7.3 一般我們用“Amplification Plot項來觀察每孔的擴(kuò)增實(shí)時曲線4.7.4 "Amplification Plot的曲線有“l(fā)oW”和 求導(dǎo)后的線性值”的2種表現(xiàn)形式，通過“Tool -Graph Settings.或通過鼠標(biāo)左鍵雙擊非曲線區(qū)依次 選擊“l(fā)inear ” - 7OKlogT'轉(zhuǎn)換到線性值”曲線。

7、4.7.5 您可以通過點(diǎn)擊每個孔來觀察所對應(yīng)的擴(kuò)增的曲線來判斷該孔的結(jié)二 0一般：依次看："N' 一 ”4等設(shè)置好T值和基線）【定量：是指 通過已知的標(biāo)準(zhǔn)參考品來判定未知】設(shè)置好 T值和基線后，然后選中“N + 4S'按住鍵盤Ctrl不放手，依次 點(diǎn)擊/再點(diǎn)擊 某未知樣品孔來判定 該孔樣品的擴(kuò)增曲線，并結(jié)合“Plate” “Report?目錄 來定量該孔樣品的Qty值。4.2 維護(hù)方法4.2.1 微軟件 Windows NT 工作站的維護(hù)硬盤驅(qū)動器每月29 日左右運(yùn)動一次碎片清除程序，使用Norton Utilities 或類似軟件。具體步驟：a） 放入 Norton

8、 Utilities 光盤。b） My Computer 打開 Norton Utilities 軟件光盤。c） 啟動清理碎片/優(yōu)化程序。d） 運(yùn)行完成后，檢查以確信無嚴(yán)重錯誤記錄，退出Norton Utilities 。e） 取出 Noton Utilities 光盤，重新啟動計算機(jī)。CR 儀的維護(hù)5.2.2.1 樣品槽的清潔樣品槽每月29 日左右進(jìn)行一次清潔，如出現(xiàn)樣品槽污染情況則隨時清潔。操作方法：a） 確定污染物的來源和位置:用少量的去離子水,清潔樣本塊中包含污染物的反應(yīng)孔 .b） 執(zhí)行背景校正后,還是發(fā)現(xiàn)有些孔中還有污染物時用少量95%EtOH 溶液 ,清潔樣本塊中包含污染物的反應(yīng)孔

9、.c） 執(zhí)行背景校正后,還是發(fā)現(xiàn)有些孔中還有污染物時用少量10%漂白溶液,清潔樣本塊中包含污染物的反應(yīng)孔,直至污染物去掉d） 如果依然存在污染物,請與美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司技術(shù)支持聯(lián)系.4.2.3 ABI PRISM 7300 光路系統(tǒng)的維護(hù)4.2.3.2調(diào)準(zhǔn)ROI 參照條調(diào)準(zhǔn) ROI 參照條在儀器更換鹵素?zé)?、儀器定期校準(zhǔn)或儀器維修后進(jìn)行。不得由一般實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行該項操作。a） PCR儀樣品槽中放入熒光檢測板。b） 將 ABI PRISM 7300光源檢測器向前拖動蓋信樣品槽，并旋緊。c）從Start菜單選擇運(yùn)行 ABI PRISM 7300 SDS管理軟件。d）積分時間從1024ms開始，用位置

10、調(diào)整后，調(diào)節(jié) ROI的高度與右邊線。e）逐漸增加積分時間，直到可以看到至少四個塊（約4096ms）通過。f） 調(diào)整最左側(cè)位置調(diào)整點(diǎn)。g）減少積發(fā)時間到2048ms,調(diào)整上方與底部的位置調(diào)整點(diǎn)。h） 減少積分時間以便最右側(cè)塊可見但未飽和（約1024ms） ， 調(diào)節(jié)最右側(cè)位置調(diào)整點(diǎn)。如有需要用右上角拖動點(diǎn)調(diào)整圖像的傾斜度（以左上角為中心旋轉(zhuǎn)）。i） 調(diào)節(jié)后的參照條寬度必須在ROI 參照塊間有小空隙。4.2.3.2校正 ROI 光路ROI 光路校正每月29 日左右進(jìn)行一次，以便確信結(jié)果仍然是優(yōu)化的。a）在PCR儀樣品槽中放入熒光檢測板。b） 將 ABI PRISM 7300光源檢測器向前拖動蓋住樣品

11、槽，并旋緊。c）從Start菜單選擇運(yùn)行 ABI PRISM 7300 SDS管理軟件。d）點(diǎn)選Show ROI復(fù)選框。每個樣品也周圍出現(xiàn)一藍(lán)色橢圓圈。e）點(diǎn)選 Show Saturation復(fù)選框。f）設(shè)定積分時間為1024ms；打開鹵素?zé)艉凸忾l。g） 點(diǎn)擊 LIVE 按鈕獲取圖像，然后在任何地方左擊停止。獲取中等程度未飽和圖像（無紅色圖像）。h）從Edit菜單中選擇Calibrate POIs每個孔選取合適的ROI,確定96孔都被藍(lán)色橢圓圈正確界定。i) 圖像太亮太暗都會出現(xiàn)錯誤信息，相應(yīng)增加或減少積分時間，并重復(fù)上述第 8 步直到無錯誤信息出現(xiàn)。j) 檢查也 ROI 集團(tuán)， 所有孔住處都

12、應(yīng)包含在96 個 ROI 橢圓圈中。如果沒有，重復(fù) 8 和 9 步。4.2.3.3檢查PCR儀樣品槽的熒光污染檢查 PCR 儀樣品槽的熒光污染每月5 日進(jìn)行一次，如有需要隨時進(jìn)行。a) 開啟ABI PRISM 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測信電源。b)從Start菜單選擇運(yùn)行 ABI PRISM 7300 SDS管理軟件。c) 從樣品槽中移去反應(yīng)板。d) 將 ABI PRISM 7300光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。e)設(shè)定積分時間為1024ms打開鹵素?zé)艉凸忾l。f) 點(diǎn)擊LIVE 按鈕獲取圖像，然后在任何地方左擊停止。g) 觀察96孔中背景熒光，如孔有顯著熒光則表示該孔存在熒光污染。h)

13、 按照樣品槽的清潔程序清洗樣品槽。4.2.3.4更換鹵素?zé)魞x器使用大約2000 小時后應(yīng)更換鹵素?zé)?，但具體要示鹵素?zé)魧?shí)際情況而定。a) 關(guān)閉ABI PRISM 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀，冷卻15分鐘。b) 移去ABI PRISM 7300光源檢測器頂蓋。c) 移去鹵素?zé)繇斏w。d) 把舊燈泡從插座中滑出，更換新鹵素?zé)?。確信燈正確安裝在位置上?；瑒訜襞輹r要輕輕抬起燈以避開裝配螺絲釘。重新裝上燈頂蓋和ABI PRISM 7300光源檢測器頂蓋。e) 開啟 ABI PRISM 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀電源，運(yùn)行ABI PRISM 7300SDS管理軟件。f) 通過軟件控制鹵素?zé)糸_關(guān)，確認(rèn)燈隨開

14、關(guān)開閉。g) 開啟光閘，確認(rèn)光閘可打開。h)設(shè)定積分時間為1024ms,點(diǎn)擊LIVE。保證要以采集一幅數(shù)據(jù)圖像。i) 若新鹵素?zé)舨还ぷ?，ABI PRISM 7300電源保險管可能有問題。j) 也可以用自動調(diào)節(jié)光源.424、校準(zhǔn)：ABI7300 基因擴(kuò)增檢測儀校準(zhǔn)工作需由專業(yè)工程師進(jìn)行，每年校正一次， 另外以實(shí)驗(yàn)判斷儀器校準(zhǔn)狀態(tài)也可為何時進(jìn)行儀器校準(zhǔn)提供信息。通過對室內(nèi)質(zhì)控圖的分析，及時發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差的出現(xiàn)。經(jīng)過分析排除了試劑和人員誤差后，應(yīng)進(jìn)行儀器狀態(tài)校驗(yàn)實(shí)驗(yàn)：424.1 使用標(biāo)準(zhǔn)化試劑作為校驗(yàn)試劑，分別計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距、相關(guān)性的控制限。424.2 每年10月由固定人員進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，儀器

15、若搬動或配套儀器(如UPS等)的變動亦需進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的三個參數(shù)是否處在控制范圍和103 標(biāo)準(zhǔn)品是否檢出。424.3 當(dāng) 103標(biāo)準(zhǔn)品未檢出、標(biāo)準(zhǔn)曲線的三個參數(shù)超出控制范圍或僅出現(xiàn)后者時，先排除實(shí)驗(yàn)的人員、試劑因素，再重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如結(jié)果依然，聯(lián)系廠家進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。424.4 當(dāng)僅有103標(biāo)準(zhǔn)品未檢出時，檢查實(shí)驗(yàn)全過程。再次上機(jī)檢測103標(biāo)準(zhǔn)品兩枚。如仍未檢出，則聯(lián)系廠家進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。424.5 儀器經(jīng)過校準(zhǔn)后，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，結(jié)果歸入儀器檔案。注意事項：a） 儀器應(yīng)放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。b） 環(huán)境溫度保持在23左右，濕度保持在60%c）儀器

16、應(yīng)配備功率3000w的穩(wěn)壓器。d） 儀器應(yīng)定期清潔維護(hù)。e） 儀器使用時應(yīng)嚴(yán)格遵守上述使用步驟。5、擴(kuò)增分析程序5.1 核酸擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序擴(kuò)增反應(yīng)前須先在ABI PRISM 7300職 SDS 軟件的設(shè)置面板上按照事先排好的標(biāo)本位置進(jìn)行設(shè)置。每次實(shí)驗(yàn)除了待檢標(biāo)本，還要包括一個陰性對照、一個陽性對照、一個陽性室內(nèi)質(zhì)控品、一組陽性標(biāo)準(zhǔn)品（4 個梯度107、 106、 105、 104）。5.1.1 依次打開電腦顯示器和電腦主機(jī)的電源開關(guān)，進(jìn)入Windows NT 界面。5.1.2 接關(guān)打開光源檢測器和PCR儀電源開關(guān)，預(yù)熱5分鐘。5.1.3 擊 ABI PRISM 7300 SDS 圖標(biāo)，打開軟件。

17、5.1.4 在 New plate Application 窗口分別選定 ABI PRISM 7300SYBR Green,然 后單擊OK,打開一空白設(shè)置面板。5.1.5 在Setup版面設(shè)定樣品種類與名稱，數(shù)量。a）在Type欄中選擇類別：STND-標(biāo)準(zhǔn)梯度，UNKN-未知樣品，NTC-陰性對照，Not in use 冰使用。b）再在Name欄中依次輸入樣品名稱c） 在框定所選標(biāo)準(zhǔn)梯度孔數(shù)后，需在工具欄中單擊P 窗口，選定PR1 PrimerSYBR 后，關(guān)閉窗口，可見所選孔左下角有一長方形陰影。d） 在框定所選孔數(shù)后，在工具欄中單擊Q 窗口， 即可在此窗口輸入定值標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)量。5.1.6

18、 點(diǎn)擊Instrument即可在此窗口設(shè)定循環(huán)參數(shù)。5.1.7 選取定任務(wù)欄File中的Save項，彈出對話框。在對話框中的 File Name 項下輸入一組數(shù)字和（或）字母組成的文件名，選Save.5.1.8 檢查設(shè)置正確與否。5.1.9 運(yùn)行程序：a） 在設(shè)置完程序文件Instrument 窗口，點(diǎn)RUN 鍵，即可運(yùn)行。b）反應(yīng)結(jié)束后，選任務(wù)欄File中的Save項，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.2 結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)τ贏BI PRISM7300結(jié)果曲線的分析，應(yīng)按以下步驟進(jìn)行：全部曲線一一陰性對照陽性對照陽性室內(nèi)質(zhì)控品陽性標(biāo)準(zhǔn)品逐個分析（標(biāo)出陽性標(biāo)本和可疑標(biāo)本）結(jié)結(jié)調(diào)整參數(shù)，獲得較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示定量結(jié)果結(jié)結(jié)登記，發(fā)報告。5.2.1 整體曲線的觀察將所有曲線選中進(jìn)行整體觀察a） 觀察是否存在污染情況（包括標(biāo)本污染和試劑污染），特別應(yīng)注意大量曲線在同一Ct 值出現(xiàn)上漲的情況。b） 觀察是否有光跑傳導(dǎo)阻滯或電壓波動等機(jī)器原因形成的異常曲線。5.2.2 陰性對照的分析陽性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陽性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，避免假陰性的出現(xiàn)。5.2.4 陽性室內(nèi)質(zhì)控品的分析陽性室內(nèi)質(zhì)控品：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知和未知濃度的陽性室內(nèi)質(zhì)控血清。作用：用以監(jiān)控日常實(shí)