基因與分子生物學(xué)考試+位景香

1、第一講染色體1、 染色質(zhì)與染色體的基本概念染色體（chromosome）是細(xì)胞在有絲分裂時(shí)遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密包裝的結(jié)果。真核生物的染色體在細(xì)胞生活周期的大部分時(shí)間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位核小體(nucleosome)成串排列而成的。1.DNA 包裝成染色（質(zhì)）體的重要性(1)壓縮以適應(yīng)細(xì)胞的微小空間(2)保護(hù) DNA(3)便于DNA復(fù)制與分離(4)便于調(diào)控基因表達(dá)和實(shí)現(xiàn)基因重組2.染色體的復(fù)制與分離染色體DNA關(guān)鍵序列:(1)自主復(fù)制序列（autonomously replicati

2、ng sequence，ARS）：與染色體DNA復(fù)制有關(guān)(2)著絲粒序列（centromere DNA sequence，CEN）：與染色體復(fù)制后平均分配到子代細(xì)胞中有關(guān)(3)端粒DNA序列（telomere DNA sequence，TEL）：與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)3. 端粒（telomere）:染色體末端的特化結(jié)構(gòu)，由端粒DNA和端粒蛋白質(zhì)構(gòu)成。2、 核小體 核小體與組蛋白的結(jié)構(gòu)1. 核小體的組裝（1）DNA首先結(jié)合H3.H4四聚體（2）與2個(gè)H2A.H2B二聚體結(jié)合形成核小體（3)H1最后加入三、DNA的修復(fù)、重組與轉(zhuǎn)座DNA突變與修復(fù)問題（1.）DNA如何足夠快速修復(fù)以防止錯(cuò)誤成為突變存

3、在于遺傳物質(zhì)中復(fù)制子中的35外切酶元件可將錯(cuò)誤摻入的核苷酸去除（2.）在修復(fù)過程中如何區(qū)分母鏈與子鏈？MutH對切割位點(diǎn)和DNA鏈的選擇1. 切割5-GATC-3的52. 切割5-GATC-3中A未甲基化的DNA鏈（3）當(dāng)DNA斷裂或嚴(yán)重?fù)p傷致使原有序列不能被讀取時(shí)，細(xì)胞如何修復(fù)正確的DNA序列？（4）細(xì)胞如何應(yīng)對阻礙復(fù)制的損傷？1. 錯(cuò)配修復(fù)將逃脫校正讀碼的錯(cuò)誤去除MutS識別并結(jié)合到錯(cuò)配堿基處MutS和錯(cuò)配的DNA共同募集MutL和MutHMutL激活MutH，MutH在錯(cuò)配堿基附近切斷一條鏈UvrD解旋酶從切口向錯(cuò)配堿基方向解開DNA雙鏈核酸外切酶VIII或RecJ，或核酸外切酶I去除含

4、有錯(cuò)配堿基的DNA片段由DNA聚合酶III填補(bǔ)空缺并由DNA連接酶結(jié)合2 .DNA dmageIntroduction of DNA mutation and repair類型 損傷 酶錯(cuò)配修復(fù) 復(fù)制錯(cuò)誤 E.coli中MutS、MutL和MutH人類中MSH、MLH和PMS光激活作用 嘧啶二聚體 DNA光解酶堿基切除修復(fù) 受損的堿基 DNA糖基化酶核苷酸切除修復(fù) 嘧啶二聚體 E.coli中UurA、B、C、D,人類 堿基上的大加合物 XPC/A/D、ERCCI-XPF以及XPG雙鏈斷裂修復(fù) 雙鏈斷裂 E.coli中RecA和RecBCD移損DNA合成 嘧啶二聚體或脫嘌呤位點(diǎn) Y家族DNA聚合

5、酶，如E.coli的UmuC3.切除修復(fù) (excision repair)3.1堿基切除修復(fù)（base excision repair）DNA糖基化酶識別錯(cuò)誤堿基并將其除去，形成脫氧戊糖AP核酸內(nèi)切酶切除脫堿基戊糖DNA聚合酶I以未受損的DNA鏈為模板合成新鏈，DNA連接酶連接新鏈3.2核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair）UvrA-UvrB識別并結(jié)合損傷堿基所產(chǎn)生的扭曲位點(diǎn)，且UvrA脫離UvrB使損傷堿基附近DNA變性，產(chǎn)生單鏈凸起UvrB募集UvrC，UvrC在錯(cuò)誤堿基兩側(cè)切開DNAUvrD除去被切割的DNA片段，Pol和連接酶修補(bǔ)缺口4轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA

6、修復(fù)：a。RNA聚合酶在損傷上游正常轉(zhuǎn)錄DNA。（P279）b。遇到1損傷時(shí)，RNA聚合酶受阻，轉(zhuǎn)錄停止c.RNA聚合酶招募核苷酸切除修復(fù)蛋白到損傷部位，修復(fù)蛋白能觸及損傷5. 同源重組機(jī)制的Holliday模型兩個(gè)同源DNA排列整齊DNA斷裂，產(chǎn)生單鏈區(qū)（288）鏈入侵，產(chǎn)生異源雙螺旋DNAHolliday聯(lián)結(jié)體的形成Holliday聯(lián)結(jié)體的剪切Ø補(bǔ)丁產(chǎn)物(patch product)Ø剪接產(chǎn)物(splice product)6.移損DNA合成（282）A復(fù)制時(shí)一旦在模板中遇到損傷，DNA聚合酶III與滑動夾一起從DNA脫落下來b.被移損DNA聚合酶取代。C。移損DNA聚

7、合酶越過模板鏈?zhǔn)軗p部位，繼續(xù)進(jìn)行DNA合成，且被DNA聚合酶III取代。7.RecBCD的作用機(jī)制（295）RecBCD結(jié)合于DNA斷裂末端，向chi位點(diǎn)方向打開雙鏈RecB沿35降解單鏈DNA， RecD沿53降解單鏈DNA RecC識別chi位點(diǎn)，RecD喪失活性， RecB沿53降解單鏈DNA，而不再沿35降解單鏈DNA8.RecA蛋白的功能 ：促使鏈的入侵 Ø主要位點(diǎn)結(jié)合單鏈DNA Ø次要位點(diǎn)結(jié)合雙鏈DNAØ鏈交換（299-303）RuvAB的功能：促進(jìn)分支移動 ØRuvA-RuvB結(jié)合到聯(lián)結(jié)體 ØRuvB促使DNA分支移動RuvC的功

8、能: 剪切Holliday聯(lián)結(jié)體 ØRuvC在同一方向的同源DNA鏈打開缺口 5A/T-T-T-G/C3ØDNA連接酶連接缺口9（608） 釀酒酵母HO基因的表達(dá)調(diào)控3.2 控制釀酒酵母交配型的基因座ØMAT基因座（mating-type locus）（312）l交配型a：a1基因，編碼a1調(diào)控蛋白l交配型：1和2基因，1和2調(diào)控蛋白la/： a1、 1和2，編碼a1、1和2調(diào)控蛋白3.3 釀酒酵母交配型基因的組合控制 3.3.1 調(diào)控酵母類型的調(diào)控蛋白l交配型a：a1調(diào)控蛋白，Mcm1l交配型：1和2調(diào)控蛋白，Mcm1la/： a1、1和2調(diào)控蛋白，Mcm13.

9、3.2交配型a酵母的確立ØMcm1調(diào)控蛋白激活a型細(xì)胞特異基因的表達(dá)；無活化子，型細(xì)胞特異基因關(guān)閉Ø單倍體特異基因表達(dá)3.3.3交配型酵母的確立Ø2抑制子和Mcm1抑制a細(xì)胞特異基因的表達(dá)Ø1和 Mcm1協(xié)同激活型細(xì)胞特異基因Ø單倍體特異基因表達(dá)3.3.4 a/型酵母的確立Ø2抑制子和Mcm1抑制a細(xì)胞特異基因的表達(dá)Ø無活化子，型細(xì)胞特異基因關(guān)閉Øa1和2二聚體關(guān)閉單倍體特異基因四、位點(diǎn)特異性重組和DNA轉(zhuǎn)座（320）1.保守性位點(diǎn)特異性重組（CSSR）1.1重組位點(diǎn) 重組酶識別序列 對稱分布 交換區(qū)（crosso

10、ver region）1.2重組結(jié)果 DNA片段的插入DNA片段的缺失DNA片段的倒位1.3.1絲氨酸重組酶1.3.2酪氨酸重組酶（326）（322）絲氨酸重組酶特異位點(diǎn)重組功能絲氨酸重組酶的4個(gè)亞基分別切斷2個(gè)DNA分子的4條鏈，并且重組酶通過磷酸二酯鍵與DNA斷裂端相連重組酶二聚體亞基旋轉(zhuǎn)進(jìn)行DNA片段交換DNA鏈上-OH攻擊重組酶-DNA磷酸二酯鍵，重新形成DNA磷酸二酯，釋放重組酶，完成重組1,3,3Cre重組酶位點(diǎn)特異性重組（328）2. l整合酶催化基因整合和切除（329） 3Hin重組酶（331） 4Xer重組酶催化（335）五轉(zhuǎn)座（337）2.1轉(zhuǎn)座因子（transposabl

11、e element）或轉(zhuǎn)座子（transposon）：從DNA上的一個(gè)地方移位到另外一個(gè)地方的遺傳因子。2.2轉(zhuǎn)座因子的類型 2.2.1 DNA轉(zhuǎn)座子2.2.2 LTR (long terminal repeat) 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（339）2.2.1 DNA轉(zhuǎn)座子2.2.1.1自主轉(zhuǎn)座子（autonomous transposon） 2.2.1.2非自主轉(zhuǎn)座子（nonautonomous transposon）2.2.1.1 DNA自主轉(zhuǎn)座子 反向重復(fù)序列（具有轉(zhuǎn)座酶識別序列） 轉(zhuǎn)座酶基因2.2.1.2非自主轉(zhuǎn)座子 反向重復(fù)序列（具有轉(zhuǎn)座酶識別序

12、列）DNA 轉(zhuǎn)座子：玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)Ac：含5個(gè)外顯子的單個(gè)基因，產(chǎn)物為轉(zhuǎn)座酶; 末端有11bp的IR和8bp的DR，DR由靶位點(diǎn)重復(fù)而成。Ds：比Ac短，不同Ds缺失的長度不同； 末端有11bp的IR。2.2.2 LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 兩端有LTR (long terminal repeat) LTR中含有反向末端重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子5-UTR: untranslated region 3-UTR (聚腺苷酸序列的A-T堿基對)ORF1: 編碼RNA結(jié)合蛋白 open reading frameORF2: 編碼的蛋白質(zhì)同時(shí)具

13、有反轉(zhuǎn)錄酶和核酸內(nèi)切酶功能2.3DNA轉(zhuǎn)座的剪切-粘貼機(jī)制（342）轉(zhuǎn)座酶識別并聚集轉(zhuǎn)座子兩端的反向重復(fù)序列，形成轉(zhuǎn)座體 將DNA轉(zhuǎn)座子從原始位置切除 DNA單鏈交換，即轉(zhuǎn)座子的3-OH與靶DNA的5-P相連DNA聚合酶和DNA連接酶修復(fù)缺口3.DNA復(fù)制性轉(zhuǎn)座（345）4.類病毒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒通過RNA中間體實(shí)現(xiàn)移位（347）5. 聚腺苷酸(poly-A)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座機(jī)制（352）6.Mu噬菌體是一種異?；钴S的轉(zhuǎn)座子（361）l 很少有靶位點(diǎn)的偏好性l 每小時(shí)能完成100輪的轉(zhuǎn)座l 參與轉(zhuǎn)座酶的酶MuA:轉(zhuǎn)座酶 MuB：ATP酶，促進(jìn)MuA的活性7.V(D)J重組（366）六、基因的

14、表達(dá)與調(diào)控原核基因表達(dá)調(diào)控模式1、轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptional regulation）2、轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptional regulation）  mRNA加工成熟水平上的調(diào)控   翻譯水平上的調(diào)控1.原核操縱子的結(jié)構(gòu)組成（1)結(jié)構(gòu)基因群操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因可稱為結(jié)構(gòu)基因(structural gene, SG)。一個(gè)操縱元中含有2個(gè)以上的結(jié)構(gòu)基因，多的可達(dá)十幾個(gè)。每個(gè)結(jié)構(gòu)基因是一個(gè)連續(xù)的開放讀框, 5端有翻譯起始碼,3端有翻譯終止碼。各結(jié)構(gòu)基因頭尾銜接、串連排列，組成結(jié)構(gòu)基因群。至少在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因5側(cè)具有核糖

15、體結(jié)合位點(diǎn)。核糖體在合成完第一個(gè)編碼的多肽后，核糖體可以不脫離mRNA而繼續(xù)翻譯合成下一個(gè)基因編碼的多肽，直至合成完這條多順反子mRNA所編碼的全部多肽。（2)啟動子 (3)操縱基因操操縱元中同一操縱序列與不同構(gòu)像的蛋白質(zhì)結(jié)合，可以分別起阻遏或激活基因表達(dá)操縱元中同一操縱序列與不同構(gòu)像的蛋白質(zhì)結(jié)合，可以分別起阻遏或激活基因表達(dá)的作用(4)調(diào)控基因（regulatory gene）是編碼能與操縱序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因。與操縱子結(jié)合后能減弱或阻止其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白稱為阻遏蛋白（repressive protein），其介導(dǎo)的調(diào)控方式稱為負(fù)性調(diào)控（negative regulation）。與

16、操縱子結(jié)合后能增強(qiáng)或起動其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白稱為激活蛋白（activating protein），所介導(dǎo)的調(diào)控方式稱為正性調(diào)控（positive regulation）。(5)終止子 終止子（terminator，T）是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。在一個(gè)操縱元中至少在結(jié)構(gòu)基因群最后一個(gè)基因的后面有一個(gè)終止子。 終止子按其作用是否需要蛋白因子的協(xié)助至少可以分為兩類：一類是不依賴因子的終止子，這類終止子在序列上有一些共通的特點(diǎn)，即有一段富含GC的反向重復(fù)序列（inverted repeat sequence），其后跟隨一段富含AT的序列（見圖7-6），因而轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的序列

17、中能形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，后繼一連串U，正是RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄生成的這段mRNA的結(jié)構(gòu)阻止RNA聚合酶繼續(xù)沿DNA移動、并使聚合酶從DNA鏈上脫落下來，終止轉(zhuǎn)錄。另一類是依賴因子的終止子，即其終止轉(zhuǎn)錄的作用需要因子的協(xié)同，或至少是受因子的影響。 不同的終止子的作用也有強(qiáng)弱之分，有的終止子幾乎能完全停止轉(zhuǎn)錄；有的則只是部分終止轉(zhuǎn)錄，一部分RNA聚合酶能越過這類終止序列繼續(xù)沿DNA移動并轉(zhuǎn)錄。如果一串結(jié)構(gòu)基因群中間有這種弱終止子的存在，則前后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量會有所不同，這也是終止子調(diào)節(jié)基因群中不同基因表達(dá)產(chǎn)物比例的一種方式。 有的蛋白因子能作用于終止序列，減弱或取消終止子的作用，稱為抗終止作用（antiter

18、mination），這種蛋白因子就稱為抗終止因子（antiterminator）。2、原核基因調(diào)控機(jī)制的類型與特點(diǎn)根據(jù)操縱子對調(diào)節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的應(yīng)答，可分為：正轉(zhuǎn)錄調(diào)控 負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控正轉(zhuǎn)錄調(diào)控：與操縱子結(jié)合后能增強(qiáng)或起動其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白稱為激活蛋白（activating protein），所介導(dǎo)的調(diào)控方式稱為正性調(diào)控（positive regulation）。負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控：與操縱子結(jié)合后能減弱或阻止其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白稱為阻遏蛋白（repressive protein），其介導(dǎo)的調(diào)控方式稱為負(fù)性調(diào)控（negative regulation）。3、根據(jù)操縱子對某些能調(diào)節(jié)它

19、們的小分子的應(yīng)答，可分為可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和可阻遏調(diào)節(jié)兩大類： 可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)（P196）：指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。 例：大腸桿菌的乳糖操縱子 分解代謝蛋白的基因酶合成的誘導(dǎo)操縱子模型誘導(dǎo)物：如果某種物質(zhì)能夠促使細(xì)菌產(chǎn)生酶來分解它，這種物質(zhì)就是誘導(dǎo)物。調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白誘導(dǎo)物mRNA酶蛋白 可阻遏調(diào)節(jié)：基因平時(shí)是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)。例：色氨酸操縱子 合成代謝蛋白的基因酶合成的阻遏操縱子模型輔阻遏物：如果某種物質(zhì)能夠阻止細(xì)菌產(chǎn)生合成

20、這種物質(zhì)的酶，這種物質(zhì)就是輔阻遏物。4、在負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)其作用特征又可分為負(fù)控誘導(dǎo)和負(fù)控阻遏： 在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄； 在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（輔阻遏物）結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。5、在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。 根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為正控誘導(dǎo)和正控阻遏 在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)； 在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（輔阻遏物）的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。6、轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的

21、其他形式（1）、因子的更換 在E.coli中,當(dāng)細(xì)胞從基本的轉(zhuǎn)錄機(jī)制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達(dá)時(shí)，需要不同的s因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合。（2）、降解物對基因活性的調(diào)節(jié)葡萄糖存在時(shí),在細(xì)菌培養(yǎng)物中加入乳糖,半乳糖,阿拉伯糖,麥芽糖等不會引起相應(yīng)的操縱子啟動（3）、弱化子對基因活性的影響7、乳糖操縱子（550）主要內(nèi)容： Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼這個(gè)mRNA分子的啟動子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動子區(qū)（P），不能單獨(dú)起動合成-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時(shí)，lac

22、mRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)lac mRNA的合成。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動子能夠順利起始mRNA的合成。8、1）、lac操縱子的本底水平表達(dá)有兩個(gè)矛盾是操縱子理論所不能解釋的：誘導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)物需要透過酶，后者的合成有需要誘導(dǎo)。解釋：一些誘導(dǎo)物可以在透過酶不存在時(shí)進(jìn)入細(xì)胞？ 一些透過酶可以在沒有誘導(dǎo)物的情況下合成？真正的誘導(dǎo)物是異構(gòu)乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶的預(yù)先存在。解釋：本底水平的組成型合成：非誘導(dǎo)狀

23、態(tài)下有少量的lac mRNA合成。2）大腸桿菌對乳糖的反應(yīng)3）阻遏物lac I基因產(chǎn)物及功能Lac 操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動子控制下組成型合成的，每個(gè)細(xì)胞中有5-10個(gè)阻遏物分子。當(dāng)I基因由弱啟動子突變成強(qiáng)啟動子，細(xì)胞內(nèi)就不可能產(chǎn)生足夠的誘導(dǎo)物來克服阻遏狀態(tài)，整個(gè)lac操縱子在這些突變體中就不可誘導(dǎo)。4）葡萄糖對lac操縱子的影響如果將葡萄糖和乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能被誘導(dǎo)；一旦耗盡外源葡萄糖，乳糖就會誘導(dǎo)lac操縱子表達(dá)分解乳糖所需的三種酶。 代謝物阻遏效應(yīng)5）cAMP與代謝物激活蛋白代謝物激活蛋白（CAP）/環(huán)腺甘酸受體蛋白（CRP9、CAP的正調(diào)控?zé)o葡萄

24、糖，cAMP濃度高時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 有葡萄糖，cAMP濃度低時(shí)不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄10、協(xié)同調(diào)節(jié)當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用如無CAP存在，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。 cAMPCAP復(fù)合物與啟動子區(qū)的結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始所必需的。單純?nèi)樘谴嬖跁r(shí)，細(xì)菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時(shí)，細(xì)菌首先利用葡萄糖。11、色氨酸操縱子（trp operon）特點(diǎn): (1) trpR和trpABCDE不連鎖；(2) 操縱基因在啟動子內(nèi) (3) 有衰減子(attenuator)/弱化子 (4) 啟動子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連，二者被前導(dǎo)序列(Leader)所隔開 色氨酸操縱

25、子表達(dá)的調(diào)控有兩種方式:a.通過阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控b.通過衰減子作用trp 操縱子的阻遏系統(tǒng) ： 低Trp時(shí)：阻遏物不結(jié)合操縱基因;高Trp時(shí)：阻遏物+Trp 結(jié)合操縱基因trp 操縱子的轉(zhuǎn)錄衰減的調(diào)控 ：衰減子（attenuator）/弱化子 前導(dǎo)序列（leader sequence）1）弱化子： DNA中可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過早終止的一段核甘酸序列（123-150區(qū)）。研究引起終止的mRNA堿基序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)mRNA通過自我配對可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點(diǎn)。2）、前導(dǎo)序列：在trp mRNA5'端trpE基因的起始密碼前一個(gè)長162bp的mRNA片段。3、）弱化機(jī)制細(xì)菌通過弱化作用彌

26、補(bǔ)阻遏作用的不足，因?yàn)樽瓒糇饔弥荒苁罐D(zhuǎn)錄不起始，對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號是細(xì)胞內(nèi)色氨酸的多少；弱化作用的信號則是細(xì)胞內(nèi)載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。12、半乳糖操縱子(galactose operon)異構(gòu)酶(galE) 乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶(galT) 半乳糖激酶(galk)。gal操縱子的特點(diǎn)：它有兩個(gè)啟動子，其mRNA可從兩個(gè)不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄；它有兩個(gè)O區(qū)，一個(gè)在P區(qū)上游，另一個(gè)在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。13、阿拉伯糖操縱子（arabinose

27、 operon)araB基因、araA基因和araD, 形成一個(gè)基因簇，簡寫為araBAD 三個(gè)基因的表達(dá)受到ara操縱子中araC基因產(chǎn)物AraC蛋白的調(diào)控ara操縱子的調(diào)控有兩個(gè)特點(diǎn)：第一，araC表達(dá)受到AraC的自身調(diào)控。第二，AraC既是ara操縱子的正調(diào)節(jié)蛋白（需cAMP-CRP的共同參與，起始轉(zhuǎn)錄），又是其負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。這種雙重功能是通過AraC蛋白的兩種異構(gòu)體來實(shí)現(xiàn)的（Pi和Pr)。B）葡萄糖很豐富且沒有阿拉伯糖情況下，AraC與操縱基因araO2和AraC的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)araI結(jié)合，結(jié)合于araO2和araI的兩個(gè)AraC蛋白之間互相結(jié)合，形成一個(gè)約210堿基對的一個(gè)環(huán)，從而使

28、araBAD啟動子的轉(zhuǎn)錄被抑制，基因araB、A、D不被轉(zhuǎn)錄，阻止操縱子的轉(zhuǎn)錄（負(fù)調(diào)節(jié)作用）C）當(dāng)葡萄糖不存在（或低水平）而阿拉伯糖存在時(shí)，CAP-cAMP很豐富，與araI附近的CRP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阿拉伯糖與AraC蛋白結(jié)合改變了構(gòu)象，成為激活子，DNA環(huán)被打開，能與CAP-cAMP協(xié)同誘導(dǎo)araBAD基因的轉(zhuǎn)錄（陽性調(diào)控或正調(diào)節(jié)）阿拉伯糖和葡萄糖均不存在或阿拉伯糖和葡萄糖均豐富時(shí)，操縱子均處于阻遏狀態(tài)。14、原核生物轉(zhuǎn)錄的整體調(diào)控模式l 由成群的操縱子組成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)稱為調(diào)節(jié)子。通過組成調(diào)節(jié)子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對若干操縱子及若干蛋白質(zhì)的合成進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，從而達(dá)到整體調(diào)控的目的。l 典型的整體

29、調(diào)控模式是SOS反應(yīng)，這是由一組與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)基因組成。在正常情況下，這些基因均被LexA阻遏蛋白封閉。當(dāng)有紫外線照射時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，從而導(dǎo)致與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因表達(dá)。15、轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控1.翻譯起始的調(diào)控 RBS（核糖體結(jié)合位點(diǎn)）：mRNA鏈上起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。 RBS的結(jié)合強(qiáng)度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及其與起始密碼子AUG之間的距離。 SD- 4-10（9）-AUGSD （ Shine-Dalgarno ）序列：在起始密碼AUG上游413個(gè)堿基之前有一段富含嘌呤的序列，其一致序列（consens

30、us sequence）為AGGAGG，能與核糖體30S亞基中16S rRNA 3端富含嘧啶的序列結(jié)合，與蛋白質(zhì)合成過程中起始復(fù)合物生成有關(guān)。16.稀有密碼子對翻譯的影響dnaG(引物酶) RNA引物dnaG、rpoD和rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個(gè)操縱子50個(gè)拷貝的dnaG蛋白、2800個(gè)拷貝的rpoD和40000個(gè)拷貝的rpsU七、基因的表達(dá)與調(diào)控真核基因表達(dá)調(diào)控模式(586)調(diào)控真核生物和原核生物之間的相似1.原理是相同的：信號激活劑和阻遏 募集和變構(gòu)（異構(gòu)），協(xié)同結(jié)合2.進(jìn)行調(diào)控的基因表達(dá)的步驟是類似的，并且轉(zhuǎn)錄起始是最普遍地調(diào)節(jié)步驟。Difference in reg

31、ulation between eukaryotes and prokaryote1. ）Pre-mRNA splicing adds an important step for regulation. (mRNA前體的剪接)2. )The eukaryotic transcriptional machinery is more elaborate than its bacterial counterpart. (真核轉(zhuǎn)錄機(jī)器更復(fù)雜)3. )Nucleosomes and their modifiers influence access to genes. (核小體及其修飾體) 4. )Man

32、y eukaryotic genes have more regulatory binding sites and are controlled by more regulatory proteins than are bacterial genes. (真核基因有更多結(jié)合位點(diǎn)) Eukaryotic activators-Example 1: Gal43.Eukaryotic activators-Example 1: Gal4 活化子 ØDNA結(jié)合域和激活域功能分離實(shí)驗(yàn)介紹系列 2 酵母雙雜交3. 調(diào)控蛋白DNA結(jié)合域的類型(591)3.1同型結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（酵母2抑制子） 

33、16;3個(gè)螺旋 Ø2個(gè)螺旋形成螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋Ø識別螺旋 結(jié)合大溝 Ø結(jié)合螺旋 結(jié)合主鏈 Ø協(xié)助螺旋 協(xié)助識別和結(jié)合螺旋結(jié)合DNA3.2含鋅DNA結(jié)合域Ø鋅原子與2個(gè)組氨酸殘基和兩個(gè)半胱氨酸殘基相連接（Gal4）l1個(gè)識別螺旋l2個(gè)折疊Ø鋅原子與4個(gè)半胱氨酸殘基相互作用l類似螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋的結(jié)構(gòu)3.3亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（GCN4活化子）Ø2個(gè)螺旋Ø二聚化區(qū)l適當(dāng)間隔的亮氨酸殘基 ØDNA結(jié)合區(qū)3.4螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（小鼠MyoD活化子）Ø長螺旋 l識別結(jié)合DNA大溝 l二聚化功能Ø短

34、螺旋l二聚化功能4. 活化子DNA激活域的類型Ø酸性激活域（Gal4）Ø谷氨酰胺激活域（SP1）Ø脯氨酸激活域（CTF1）5.活化子的作用方式(594)活化子的作用方式1.活化子間接募集RNA聚合酶2. 活化子募集核小體修飾物改變啟動子染色質(zhì)性質(zhì)3. 活化子募集蛋白因子促使轉(zhuǎn)錄起始和延伸6.活化子間接募集RNA聚合酶ØRNA聚合酶不能單獨(dú)直接結(jié)合啟動子Ø轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）協(xié)助RNA聚合酶結(jié)合啟動子：TFIIDØ中介蛋白協(xié)助RNA聚合酶結(jié)合啟動子活化子通過募集轉(zhuǎn)錄因子或中介蛋白促使RNA聚合酶結(jié)合到啟動

35、子上Ø活化子募集作用的證明（Gal4活化子）（594）ChIP) (染色質(zhì)免疫共沉淀) to visualize where a given protein (activator) is bound in the genome of a living cell.) （實(shí)驗(yàn)介紹系列3）(激活子旁路實(shí)驗(yàn))-Activation of transcription through direct tethering of mediator to DNA. （實(shí)驗(yàn)介紹系列4）（595）7. 活化子募集核小體修飾物改變啟動子染色質(zhì)性質(zhì)（595）2.2 核小體修飾物的種類乙酰轉(zhuǎn)移酶 乙?；M蛋白中的

36、賴氨酸核小體重塑復(fù)合體 重塑核小體2.3 活化子募集乙酰轉(zhuǎn)移酶乙?；M蛋白松弛核小體上的DNA，釋放啟動子，有利于RNA聚合酶結(jié)合啟動子組蛋白的乙?；峁┚哂型凑{(diào)節(jié)域轉(zhuǎn)錄因子（TFIID）的結(jié)合位點(diǎn)2.4活化子募集重塑復(fù)合體重塑核小體Ø核小體沿DNA滑動，暴露出啟動子，有利于 RNA聚合酶的結(jié)合3. 活化子募集蛋白因子促使轉(zhuǎn)錄起始和延伸4. 絕緣子阻擋活化子對啟動子的激活作用（599）8. 基因的適當(dāng)調(diào)控需要基因座控制區(qū)（LCR）（599）9.轉(zhuǎn)錄抑制（611）11、信號整合1）激活蛋白聯(lián)合作用來整合多種信號（551）1. 活化子聯(lián)合作用促進(jìn)信號整合多個(gè)活化子各募集轉(zhuǎn)錄機(jī)器的同一組

37、分多個(gè)活化子各募集轉(zhuǎn)錄機(jī)器的不同組分多個(gè)活化子之間相互幫助結(jié)合DNA（603）（604）（605）2. 多個(gè)活化子之間相互幫助結(jié)合DNA2.1 兩個(gè)活化子直接相互作用結(jié)合DNA2.2 兩個(gè)活化子通過同一個(gè)蛋白結(jié)合DNA2.3 一個(gè)活化子募集核小體修飾物來促使另外一個(gè)活化子結(jié)合DNA 2.4 一個(gè)活化子結(jié)合核小體DNA暴露另外一個(gè)活化子結(jié)合位點(diǎn)12.組合調(diào)控（607）組合調(diào)控是真核生物復(fù)雜性和多樣性的核心。它屬于協(xié)作調(diào)控的一種具體方式。在組合調(diào)控中，激活蛋白和阻遏蛋白共同起作用。啤酒酵母的交配型的組合調(diào)控（608）同上13.信號傳導(dǎo)（612）信號傳導(dǎo)的機(jī)制：信號經(jīng)常通過不同方式控制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的

38、活性Mechanism 1: unmasking an activating region揭露活化區(qū)域（615）Mechanism 2: Transport into and out of the nucleus 運(yùn)輸進(jìn)入和離開細(xì)胞核（664b）Other Mechanisms #1: A cascade of kinases that ultimately cause the phosphorylation of regulator in nucleus (new) 激酶級聯(lián)，最終導(dǎo)致監(jiān)管者的磷酸化核664aOther Mechanisms #2: The activated recepto

39、r is cleaved by cellular proteases (蛋白酶), and the c-terminal portion of the receptor enters the nuclease and activates the regulator 激活受體被細(xì)胞蛋白酶（蛋白酶）切割，而受體的c-末端部分進(jìn)入核酸酶和激活調(diào)節(jié)器664c14.基因“沉默”由組蛋白修飾及DNA（616）在酵母中的沉默是通過對組蛋白的去乙酰化和甲基化介導(dǎo)的（617）在果蠅中，HP1蛋白識別甲基化的組蛋白和濃縮的染色質(zhì)。DNA甲基化與哺乳動物細(xì)胞的沉默基因相關(guān)聯(lián)。【注DNA甲基化不是組蛋白甲基化】（62

40、1）15.基因表觀遺傳控制有些基因表達(dá)狀態(tài)在起始信號不存在時(shí)仍然在細(xì)胞分裂中遺傳。（624）DNA甲基化通過細(xì)胞分裂維持（625）16.真核基因調(diào)控在轉(zhuǎn)錄起始后水平HSP70 gene：（597）17.RNAs基因沉默（640）八、分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)n 核酸電泳技術(shù)n 核酸的限制性酶切及片段長度多態(tài)性n 核酸分子雜交n 核酸體外擴(kuò)增技術(shù)PCR1. 核酸電泳技術(shù)按照分子量大小，形狀和拓?fù)鋵W(xué)特性進(jìn)行DNA 和 RNA分子的分離Ø DNA 與 RNA 帶負(fù)電荷, 在凝膠中朝正極（）移動Ø 線狀 DNA 分子按照分子量大小進(jìn)行分離Ø 環(huán)狀DNA的遷移受其拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)特性

41、的影響。分子量相同的環(huán)狀 DNA有不同的形狀，其遷移率不同：超螺旋> 線狀>開環(huán)或松弛態(tài)分離不同大小的DNAn 分子量小的 DNA（1-1000bp）: 用聚丙烯酰胺n 分子量大的 DNA（0.2-50kb): 用瓊脂糖n 大片段DNA(>30-50kb): 用脈沖電場凝膠電泳2.核酸的限制性酶切及片段長度多態(tài)性限制性內(nèi)切酶特點(diǎn)：1）特異性識別序列2）特異性切割位點(diǎn)限制酶識別序列長度通常為堿基對，大多呈回文序列。限制性內(nèi)切酶圖譜：也稱DNA物理圖譜，是DNA鏈上某些限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的圖譜，可作為DNA片段的特殊標(biāo)記。是DNA特征的證據(jù)。DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜的建立識別

42、4個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶，在DNA鏈上出現(xiàn)機(jī)率為: 1 / 441 / 256bpA、部分酶解法：n 完全酶解 3 ，2， 1 kbn 部分酶解 6，5，4，3，2, 1 kbn 分析 5=3+2 4=3+1 3在中間B.兩種以上限制性內(nèi)切酶交叉酶解法： 總長 EcoR Hpa 3kb 1.7，0.9，0.4 1.6，1.4 EcoR+ Hpa 1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4 分析： Hpa一個(gè)切點(diǎn)，可肯定EcoR1.7 kb不在末端，在中間EcoR 0.9和0.4 kb都在末端 邏輯判斷以上二片段在哪一邊末端C.同位素末端標(biāo)記，部分酶解法限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）的檢測在一個(gè)特定

43、基因座位上，存在著兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位基因，其中任何一個(gè)在人群中頻率不低于10%，這就是多態(tài)性但現(xiàn)在認(rèn)為不同個(gè)體中同一位點(diǎn)上DNA核苷酸序列產(chǎn)生變異，且在人群中發(fā)生頻率大于1%，就可認(rèn)為是多態(tài)性。如在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)發(fā)生核苷酸的變異（或多態(tài)性），就會產(chǎn)生RFLP，除SNP外，還包括缺失、重復(fù)、插入、基因重排以及串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)的變異限制性酶切的應(yīng)用(1) 鑒定是否是需要的DNA片段(2) 建立基因組圖譜(3) 遺傳性疾病的研究和診斷n 根據(jù)多態(tài)性片段尋找與疾病相關(guān)的基因n 診斷： 直接檢測 連鎖分析3. 核酸分子雜交 把親源關(guān)系較近的，不同生物個(gè)體來源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理

44、形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。核酸分子雜交技術(shù)的原理有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe), 與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進(jìn)行雜交。 再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等應(yīng) 用：(1)檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。 3.1 Southern 印跡雜交

45、此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測對象為DNA。吸水紙轉(zhuǎn)膜：玻璃-濾紙-凝膠-尼龍膜-濾紙（厚吸水紙）-玻璃板-重物3.2 Northern印跡雜交與Southern雜交類似。檢測目的RNA的存在與否及含量。3.3 Western印跡雜交將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。3.4 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交Dot blotting and slot blotting適于核酸樣品定量檢測，而不是定性檢測。3.5 原位雜交in situ hybridization分為菌落

46、、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交3.6 生物芯片生物芯片（biochip）是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測。 生物芯片的分類(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray)(2) 蛋白質(zhì)芯片(Protein chip)(3) 芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)基因芯片n 基因芯片：是指將大量探針分子固定在物體表面，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號強(qiáng)度，進(jìn)而獲取樣品

47、分子的數(shù)量和系列信息。n 它以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息而顯示巨大威力。n 目前，基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于基因表達(dá)檢測、尋找新基因、雜交測序、基因突變等許多方面。蛋白芯片：是以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測對象，比基因芯片更進(jìn)一步接近生命活動的物質(zhì)層面，因而有著比基因芯片更加直接的應(yīng)用前景。 DNA芯片技術(shù)的基本原理：DNA芯片技術(shù)的基本原理是分子識別，與Southern雜交和Northern雜交同出一理，即DNA的堿基互補(bǔ)配對和序列互補(bǔ)原理。 DNA芯片技術(shù)流程芯片方陣的構(gòu)建樣品制備生物分子反應(yīng)信號的檢測及分析 DNA芯片應(yīng)用可在基因組水平進(jìn)行基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)研究、突變、序列測定等，已

48、方泛應(yīng)用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領(lǐng)域。4. 核酸體外擴(kuò)增技術(shù)-PCRPCR能做什么？n PCR反應(yīng)可以在2小時(shí)內(nèi)提供大量的目標(biāo)DNA片斷n 模板DNA不需要高度純化n PCR產(chǎn)物能用于限制性內(nèi)切酶消化、測序和克隆n PCR可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至單個(gè)DNA細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定影響PCR的主要因素Template DNAReaction buffer (Tris, KCl, Mg2+, BSA)dNTPsPrimersDNA polymerasePCR反應(yīng)條件變性、退火、延伸溫度循環(huán)次數(shù)溫度循環(huán)參數(shù)n 模板變性溫度決定雙鏈DNA解鏈溫度n 引物退火溫度退火溫度決

49、定PCR特異性與產(chǎn)量n 引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度n 循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為2540個(gè)周期 擴(kuò)增結(jié)束后，樣品冷卻并置4保存引物(1)引物設(shè)計(jì)原則 引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以45-55%為宜。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體。 引物3端的堿基，最好是G或C。 正向與反向引物的退火溫度大致相同，一般為50-65 。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。(2) 引物Tm反應(yīng)的退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個(gè)Tm（一般相差2-4）折中選擇 較低的

50、退火溫度檢查擴(kuò)增的可能性較高的退火溫度最佳特異性(3) 引物輔助設(shè)計(jì)Primer Premier 5.0DNA 聚合酶 Klenow片段Taq DNA聚合酶來源大腸桿菌水棲高溫菌（Thermus aquatics）YT1蓖株有無35外切酶活力有無最適溫度37 , 擴(kuò)增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測7475產(chǎn)率高，特異性也高。到達(dá)平臺的循環(huán)次數(shù)2030延伸片段長度400bp以內(nèi)10kb以內(nèi)影響PCR特異性的因素退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸。引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減

51、少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。改變MgCl2(有時(shí)KCl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對Taq酶的直接作用。模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥苷-5-三磷酸 (de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物代替dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。(1）不對稱PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探

52、針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究(2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。3）多重PCR是指在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)序列的反應(yīng)過程，能夠節(jié)省時(shí)間和精力.4）LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、熒光素等對引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測多種基因成分5）錨定PCR（anchored PCR）

53、錨定PCR：使用一條錨定引物就一條特異性引物擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。 6）PCR固相分析法7）原位 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列原位PCR的作用 既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則

54、可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。操作步驟： 細(xì)胞或組織的固定PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物8）定量PCR：是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn),通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進(jìn)行PCR起始模板量的定量。用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 實(shí)時(shí)原理 1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 擴(kuò)增曲線2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -熒光閾值3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理-Ct值的重現(xiàn)性Ct值的特點(diǎn)：§ 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；§ Ct值則極具