二元手性選擇體系毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)未衍生化氨基酸對(duì)

1、二元手性選擇體系毛細(xì)管電泳分離二元手性選擇體系毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)未衍生化氨基酸對(duì)映體的研究檢測(cè)未衍生化氨基酸對(duì)映體的研究 姓名：陳裕富專(zhuān)業(yè)：應(yīng)用化學(xué)A導(dǎo)師：謝天堯 副教授目錄目錄前言前言實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)與討論討論結(jié)論結(jié)論致謝致謝一、一、前言前言1.毛細(xì)管電泳技術(shù)的介紹毛細(xì)管電泳技術(shù)的介紹u毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophesis, CE）是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)高效、快速分離的電泳分離分析方法。u特點(diǎn)：快速、低耗、簡(jiǎn)便、高效環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)、快速、低耗、簡(jiǎn)便、高效環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)、潔凈

2、自動(dòng)、潔凈毛細(xì)管電泳的分離模式：毛細(xì)管電泳的分離模式：u毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE）u膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）u毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）u毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦（CIEF） u毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳（CITP） u毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電色譜（CEC） u其他模式其他模式 (ACE、 CAE、CCE)毛細(xì)管電泳的檢測(cè)技術(shù)：毛細(xì)管電泳的檢測(cè)技術(shù)：u紫外檢測(cè)紫外檢測(cè)（UV） u激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器 （LIF） u質(zhì)譜檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器（MS） u電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器（EC）:電導(dǎo)檢測(cè)、電位檢測(cè)、安培檢測(cè)電導(dǎo)檢測(cè)、電位檢測(cè)、安

3、培檢測(cè)u化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器（CL）2.氨基酸手性分離的研究進(jìn)展氨基酸手性分離的研究進(jìn)展 u氨基酸是組成生物機(jī)體蛋白質(zhì)的基本成分，是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組氨基酸是組成生物機(jī)體蛋白質(zhì)的基本成分，是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料?？椀幕A(chǔ)材料。u氨基酸分子結(jié)構(gòu)中含有不對(duì)稱(chēng)的碳原子，屬于手性分子。非天然氨基酸分子結(jié)構(gòu)中含有不對(duì)稱(chēng)的碳原子，屬于手性分子。非天然的氨基酸多為外消旋體，的氨基酸多為外消旋體，D D型氨基酸一般不能為生物所利用，必須型氨基酸一般不能為生物所利用，必須在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng) L型才能被吸收。型才能被吸收。 u手性氨基酸的分離分析，在蛋白質(zhì)的研究、醫(yī)藥、食品、衛(wèi)生等手性氨基酸

4、的分離分析，在蛋白質(zhì)的研究、醫(yī)藥、食品、衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要意義，是分析化學(xué)研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。領(lǐng)域具有重要意義，是分析化學(xué)研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。氨基酸對(duì)映體分離的方法氨基酸對(duì)映體分離的方法v高效液相色譜法高效液相色譜法 （HPLCHPLC）v 高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳 （HPCEHPCE）優(yōu)點(diǎn)：靈敏、快速、分辨率高、優(yōu)點(diǎn)：靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好、樣品分析量大等重復(fù)性好、樣品分析量大等缺點(diǎn)：操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，制備的缺點(diǎn)：操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，制備的手手 性色譜柱費(fèi)用昂貴。性色譜柱費(fèi)用昂貴。優(yōu)點(diǎn)：分離效率高，分析速度優(yōu)點(diǎn)：分離效率高，分析速度快，操作簡(jiǎn)單，運(yùn)行成本低，快，操作簡(jiǎn)單，運(yùn)行成本低

5、，對(duì)環(huán)境造成的污染小，具有獨(dú)對(duì)環(huán)境造成的污染小，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，是氨基酸一種理想特的優(yōu)勢(shì)，是氨基酸一種理想的分離方法的分離方法 缺點(diǎn)：制備能力差些缺點(diǎn)：制備能力差些毛細(xì)管電泳在氨基酸對(duì)映體分離檢測(cè)中的應(yīng)用毛細(xì)管電泳在氨基酸對(duì)映體分離檢測(cè)中的應(yīng)用 u 間接拆分法間接拆分法（手性消除手性消除） u 直接拆分法直接拆分法 主客體絡(luò)合主客體絡(luò)合 配體交換絡(luò)合配體交換絡(luò)合 手性膠束包合手性膠束包合 蛋白質(zhì)親合蛋白質(zhì)親合 配體交換法配體交換法u是分離手性氨基酸的一種最早的方法，通常指中心離是分離手性氨基酸的一種最早的方法，通常指中心離子和子和L L型氨基酸或是縮二氨酸形成螯合物做手性選擇劑，型氨基酸或是縮

6、二氨酸形成螯合物做手性選擇劑，利用對(duì)映體和螯合物形成不同不對(duì)稱(chēng)物的穩(wěn)定性和光利用對(duì)映體和螯合物形成不同不對(duì)稱(chēng)物的穩(wěn)定性和光學(xué)結(jié)構(gòu)的差異而達(dá)到分離。學(xué)結(jié)構(gòu)的差異而達(dá)到分離。u中心金屬離子一般是中心金屬離子一般是CuCu2 2, Zn, Zn2 2, Ni, Ni2 2, Mn, Mn2 2, Co, Co2 2等，其中等，其中CuCu2 2最為常用、有效。最為常用、有效。3.苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)對(duì)映體研究進(jìn)展對(duì)映體研究進(jìn)展 苯丙氨酸(Phe)是一種重要的氨基酸，主要用作試劑及醫(yī)藥上的胃腸外營(yíng)養(yǎng)輸液，亦見(jiàn)用作特殊人員合成膳食、必需氨基酸片等營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的成分；還可作為昆蟲(chóng)人工飼料的成分；對(duì)治療

7、蘋(píng)果皰茄病亦有效。 L-苯丙氨酸是人和動(dòng)物所需要的一種氨基酸，而D-苯丙氨酸是生產(chǎn)艾滋病病毒抑制劑的重要中間體。Fig. 1 The structure of Phenylalanine(pI = 5.48) 苯丙氨酸對(duì)映體的拆分方法：苯丙氨酸對(duì)映體的拆分方法：手性膜法、薄層色譜、離子色譜法、高效液相色譜和毛細(xì)管電泳等 拆分原理拆分原理拆分模式拆分模式手性選擇劑手性選擇劑檢測(cè)方法檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)間接拆分區(qū)帶電泳（CZE）Cu2+L-Arg紫外檢測(cè)Electrophoresis. 1999,20: 1842-1845 間接拆分膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 (MECC)Cu2+ L-Pro紫外檢測(cè)A

8、nal.Chim.Aca 523(2004) 1-7直接拆分非水毛細(xì)管電泳(NACE)Cu2+ L-Pro紫外檢測(cè)J.Chromatogr.A,2000,874:285-292直接拆分膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 (MECC)Cu2+ L-Lys紫外檢測(cè)J.Chromatogr.A,2002,945:249-255 表1毛細(xì)管電泳拆分氨基酸對(duì)映體的比較4.研究背景及意義研究背景及意義 目前所采用的檢測(cè)方法通常以目前所采用的檢測(cè)方法通常以光學(xué)檢測(cè)（紫外和熒光）光學(xué)檢測(cè)（紫外和熒光）為主，由于大部分氨基酸都缺乏光學(xué)活性，需進(jìn)行柱前或?yàn)橹鳎捎诖蟛糠职被岫既狈鈱W(xué)活性，需進(jìn)行柱前或柱后衍生化處理才能檢測(cè)，操

9、作費(fèi)時(shí)繁瑣，且易引入新的柱后衍生化處理才能檢測(cè)，操作費(fèi)時(shí)繁瑣，且易引入新的誤差誤差 。 電化學(xué)檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè)作為一種靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)方法作為一種靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)方法在毛細(xì)管電泳分離分析中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，其中電導(dǎo)在毛細(xì)管電泳分離分析中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，其中電導(dǎo)檢測(cè)法具有通用性，氨基酸無(wú)須經(jīng)過(guò)衍生即可檢測(cè)，操作檢測(cè)法具有通用性，氨基酸無(wú)須經(jīng)過(guò)衍生即可檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單方便簡(jiǎn)單方便。 本論文利用本課題組研制開(kāi)發(fā)的本論文利用本課題組研制開(kāi)發(fā)的CES2003型毛細(xì)管型毛細(xì)管電泳儀，主要采用電導(dǎo)檢測(cè)的方法，分離檢測(cè)了未衍生電泳儀，主要采用電導(dǎo)檢測(cè)的方法，分離檢測(cè)了未衍生化的苯丙氨酸對(duì)映體

10、，并對(duì)分離機(jī)理進(jìn)行了初步探討化的苯丙氨酸對(duì)映體，并對(duì)分離機(jī)理進(jìn)行了初步探討。Fig.2 CES2003型毛細(xì)管電泳儀器示意圖二、實(shí)驗(yàn)及討論二、實(shí)驗(yàn)及討論2.1儀器儀器與試劑與試劑CES2003毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀(高壓電源，安培高壓電源，安培/電導(dǎo)檢測(cè)器，毛細(xì)管數(shù)據(jù)工作站電導(dǎo)檢測(cè)器，毛細(xì)管數(shù)據(jù)工作站)pHS-3C型酸度計(jì)型酸度計(jì)熔融石英毛細(xì)管柱熔融石英毛細(xì)管柱（50cm50m I.D.）CQ-2B型超聲波清洗器型超聲波清洗器u分析純：氫氧化鈉（分析純：氫氧化鈉（NaOHNaOH），檸檬酸），檸檬酸(C(C6 6H H8 8O O7 7H H2 2O)O)，乙酸銅（，乙酸銅（Cu(CHCu(

11、CH3 3COO)COO)2 2H H2 2O O，羥丙基甲基纖維素（羥丙基甲基纖維素（HPMCHPMC）u層析純：層析純：L-L-苯丙氨酸，苯丙氨酸，D,L-D,L-苯丙氨酸、苯丙氨酸、L-L-賴(lài)氨酸賴(lài)氨酸u所用水為二次去離子重蒸水所用水為二次去離子重蒸水 連接好毛細(xì)管電泳儀和檢測(cè)裝置，毛細(xì)管柱在使用前用0.1 mol/L HCl溶液、去離子水、0.1 mol/L NaOH溶液、去離子水和運(yùn)行緩沖液分別沖洗約5 min，檢測(cè)電極用超聲波清洗。 更換緩沖液或者每進(jìn)樣6次后也需按上述步驟清洗毛細(xì)管和電極。 實(shí)驗(yàn)條件：室溫(25)、相對(duì)濕度小于75%。2.2 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

12、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論Fig.3 The effect of three different chiral selectors on the resolutiona. Cu(II) b. Cu(II)+L-lys c. Cu(II)+L-Lys+HPMC2.3.1 手性選擇體系的選擇手性選擇體系的選擇2.3.2 銅和銅和L-賴(lài)氨酸絡(luò)合物配比和濃度對(duì)分離度的影響賴(lài)氨酸絡(luò)合物配比和濃度對(duì)分離度的影響 Conditions: 1.0 mmol/L NaOH+ 0.4 mmol/L Cit+ 20 mg/L HPMC; working voltage: 15 kV; injection time: 8 s;

13、injection voltage: 9.0 kV. concentration ratio of Cu() to L-Lys(mmol/L : mmol/L) 1 : 11 : 1.51 : 21 : 3Rs01.01.31.3concentration of Cu() and L-Lys(mmol/L : mmol/L) 0.75:1.51.0:2.01.5:3.02.0:4.0Rs0.61.30.40.2Tab. 2 The effect of concentration ratio of Cu() to L-Lys , concentration of Cu() and L-Lys o

14、n the resolution 2.3.3 羥丙基甲基纖維素羥丙基甲基纖維素（HPMC）濃度對(duì)濃度對(duì)分離度的影響分離度的影響 Fig.4 The structure of hydroxypropyl methyl celluloseFig.5 The effect of HPMC concentrationConditions: 1.0 mmol/L NaOH+ 0.4 mmol/L Cit +1.0 mmol/L Cu(Ac)2+2.0 mmol/L L-ys; working voltage: 15 kV; injection time: 8 s; injection voltage:

15、9.0 kV. 2.3.4 緩沖溶液的組成、濃度及緩沖溶液的組成、濃度及pH的影響的影響 對(duì)比檸檬酸(Cit)氫氧化鈉(NaOH)、乙酸鈉(NaAc)氫氧化鈉(NaOH)、檸檬酸(Cit)三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸(H3BO3)乙酸(HAc)和乙酸銨(NH4Ac)乙酸(HAc)這幾種緩沖體系，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有在檸檬酸(Cit)氫氧化鈉(NaOH)緩沖體系中，苯丙氨酸對(duì)映體才能得到分離。 檸檬酸濃度對(duì)對(duì)映體的分離影響很大，濃度太低，對(duì)映體得不到完全分離；濃度太高，對(duì)映體也得不到分離；濃度更高，沒(méi)有對(duì)映體峰出現(xiàn)，故實(shí)驗(yàn)選擇 Cit 濃度為0.4 mmol/L。固定檸檬酸濃度后，加入氫氧化鈉以調(diào)

16、節(jié)運(yùn)行液的pH。Tab.3 The effect of NaOH concentration on the resolutionConditions: 0.4 mmol/L Cit +1.0 mmol/L Cu(Ac)2 +2.0 mmol/LL-Lys+ 20 mg/L HPMC; other conditions as Fig.5The conc. of NaOH（mmol/L） 00.20.40.81.01.2pH4.85.05.25.86.06.3Resolution(Rs) 0.60.91.01.11.31.22.3.5 進(jìn)樣方式的選擇進(jìn)樣方式的選擇 對(duì)比了氣壓進(jìn)樣、重力進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)

17、樣三種方式對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果的影響。電動(dòng)進(jìn)樣具有較好的精密性，且操作簡(jiǎn)單，但是進(jìn)樣量較大時(shí)會(huì)引起區(qū)帶展寬，使分離度下降，線(xiàn)性范圍較窄；采用壓力進(jìn)樣的峰形較窄，重現(xiàn)性不好，靈敏度較低，分離度沒(méi)有改善；采用重力進(jìn)樣，分離度下降，且會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)峰。 本實(shí)驗(yàn)采用電動(dòng)進(jìn)樣方式，進(jìn)樣電壓為9.0kV，進(jìn)樣時(shí)間為8 s。 2.3.6 分離電壓的選擇分離電壓的選擇 考察了分離電壓從9 kV至20 kV對(duì)分離的影響，電壓較低時(shí)，樣品分離度增大，但是分離時(shí)間太長(zhǎng)；加大分離電壓，可以縮短分離時(shí)間，但同時(shí)分離電流也增加，產(chǎn)生的焦耳熱也增大，體系運(yùn)行不穩(wěn)，甚至有氣泡產(chǎn)生，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)效果，柱效和分離度下降。 本實(shí)驗(yàn)選擇分離電

18、壓為15 kV。 2.3.7 線(xiàn)性范圍、檢出限和精密度線(xiàn)性范圍、檢出限和精密度 相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，L-苯丙氨酸的遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2和4.0Tab.3 The linear calibration curve of Phe 樣品回歸方程線(xiàn)性范圍（mg.L-1)相關(guān)系數(shù)檢出限（ mg.L-1）L-Phey=16.0+12.7x102000.9983Fig.6 The linear calibration curve of PheConditions: 1.0 mmol/L NaOH+0.4 mmol/L Cit+1.0 mmol/L Cu(Ac)2+2.0 mmo

19、l/LL-Lys+20 mg/L HPMC; other conditions as Fig.5Fig.7 The electropherogram of D,L-PheConditions: 1.0mmol/LNaOH+0.4 mmol/LCit +1.0mmol/L Cu(Ac)2 +2.0mmol/LL-Lys+ 20 mg/L HPMC; other conditions as Fig.52.4 拆分機(jī)理初步探討拆分機(jī)理初步探討 銅離子與銅離子與L-賴(lài)氨酸以賴(lài)氨酸以1 : 2形成三元絡(luò)合物：形成三元絡(luò)合物： L-Lys+ Cu() (L-Lys)Cu() L-Lys + (L-Lys)Cu() (L-Lys)2Cu 當(dāng)苯丙氨酸進(jìn)入緩沖系統(tǒng)時(shí)，當(dāng)苯丙氨酸進(jìn)入緩沖系統(tǒng)時(shí)，D-Phe和和L-Phe分別取代一分分別取代一分子的子的L-Lys，形成兩種不同的三元絡(luò)合物：，形成兩種不同的三元絡(luò)合物： (L-Lys)Cu(L-Lys)+ L-Phe(L-Lys) Cu(L-Phe)+ L-Lys (L-Lys)Cu(L-Lys)+ D-Phe(L-Lys) Cu(D-Phe)+ L-Lys 根據(jù)兩者的穩(wěn)定性和光學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，引起二者的電泳淌度根據(jù)兩者的穩(wěn)定性和光學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，引起二者的電泳淌度不同，不同，D