共聚焦操作流程

1、實驗環(huán)境觀察儀器是否有外表明顯損壞，如需開啟空調，一般控制在25度。拉上窗簾，避免標本熒光淬滅及雜光干擾。開機查看實驗記錄，確認是否馬上能開機（注意：汞燈必須在關機20分鐘以后才能再開啟,般為30分鐘）。確認后可執(zhí)行以下操作：（務必先開電源，后開鑰匙！!）01、打開PSU（主電源）2、打開激光器（只開啟需使用的激光器）1）、氮離子多線激光器（458/488/515,應用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP等）。2） MCPSU半導體綜合激光器（LD405應用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635應用染料：CY5/Alexa647等）。3） LD55

2、9激光器（注意：電源打開后不要馬上開鑰匙，等待TEMP指示燈不閃爍后，再開鑰匙，紅色指示燈不閃爍后，可正常使用）。3、打開顯微鏡電源IX2-UCB4、打開熒光汞燈（注意：開啟后，“15分鐘內勿關”）UserID:Adminislratw5、打開電腦主機、顯示器，登陸windowsxp系統(tǒng)d旭皆，雙擊共聚焦軟件User10.月Jniinish若ter,打開FV10-ASW應用軟件.，-8打取圖1、DIC（微分干涉差）明場立體圖（1）、插入起偏鏡、檢偏鏡（DIC滑塊）。（2）、FV10-ASW軟件中點擊透射光觀察按鈕打開鹵素燈快門，使用TD滑塊（軟件TDlamp項）控制鹵素燈的光強，倒置顯微鏡下觀

3、察標本，進行標本聚焦。1）、使用手控面板選擇合適倍率的物鏡下觀察（注意若用60X油鏡時，檢偏鏡部位要推上彎桿）,并檢查各物鏡對應的DIC元件。2）、可在檢偏鏡部位用旋鈕進行對比度的調節(jié)。（需要時可使用，一般勿調）（3）、FV10-ASW軟件中點擊透射光觀察按鈕,關閉鹵素燈快門。打開DIC通道，執(zhí)行取圖操作。1）、調節(jié)掃描速度至最快（2.0us/pixel）,size為512by,點擊整呵遍,進行快速預掃，尋找焦平面。步驟：適當調節(jié)HV、gain及offset參數;貫a“以（一般為能看到圖像即可），快速調尋找焦平面，如需放大光學倍數，可適當調節(jié)一。點擊，停止預掃描。2）、選擇AutoHV,放慢掃

4、描速度（掃描速度越慢，掃描時間越長，圖像信噪比好，但耗時，易淬滅，一般為10-12.5us/pixel）,size為640by,點擊燈刖爐或進行再預掃,調節(jié)HV、gain及offset參數至圖象清晰尖銳即可。點擊湍,停止預掃描。FifteiMode3）、若背景噪音仍過多也可選上KMrm1”來降低隨機噪音干擾（次數越多降噪越好，但掃描時間也越長，一般在HV較高時使用）。4）、點擊進行取圖，并保存。（注意：原始圖像一定要保存為oib格式）朝MoOe5）、去掉乩訕血”，將掃描速度、size恢復至初始狀態(tài)（掃描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel,size為512by）,為下一個標本做好準備。

5、2、熒光圖（1）、拉出檢偏鏡（DIC滑塊），打開汞燈機械快門（shutter）。（2）、FV10-ASW軟件中點擊汞燈觀察按鈕V,打開汞燈快門，倒置顯微鏡下觀察標本，進行標本聚焦（找視野）。使用手控面板，根據標本熒光探針選擇合適的熒光慮色片及選擇合適的物鏡下觀察，WU紫外激發(fā)/藍色熒光（eg:DAPI）,WB藍色激發(fā)/綠色熒光（eg:FITC、EGFP）,WG綠色激發(fā)/紅色熒光（eg:TexasRed,Rhodamine,DsRed>（一般要求標本在所用的各種熒光探針匹配的熒光慮色片下均能觀察到所需視野，eg:DAPI+FITC+TexasRed多色熒光探針，需在WU,WB,WG下均能觀

6、察到所需視野，DAPI一般熒光較強，FITC或TexasRed下易找些）。（注意：更換不同倍數物鏡時應適當降低物鏡再更換，以免損壞物鏡；若用60X油鏡時，要插入檢偏鏡并推上彎桿。）（3）、FV10-ASW軟件中點擊汞光觀察按鈕T,關閉汞燈快門。執(zhí)行取圖操作。1）、點擊_一,添加熒光染料。（最多為三色，多于三色需分別掃描）若標本使用的熒光染料不是染料庫里的染料，可選激發(fā)光及發(fā)射光譜較接近的染料代替，這時可適當調整2）、調節(jié)掃描速度至最快（2.0us/pixel）,size為512by,點擊燈刖岫承，進行快速預掃，尋找焦平面。imiI*IT7531步驟：適當調節(jié)HV、gain及offset參數;如

7、（一般為能看到各通道圖像即可）快速調節(jié),如需放大光學倍數，可適當調節(jié)預掃描。v Se rnelllldl3）、選上 I* Line皿（雙染以上一定要選上，可避免激發(fā)光用色），選才? AutoHV（AutoHV功能為自動匹配掃描速度與HV值，不選易造成圖像出現強度過飽和狀態(tài)），放慢掃描速度（一般為10-12.5 us/pixel）一size為640by,點擊融陋叫 進行再預才g,調節(jié)HV、gain及offset參數至圖象清晰尖銳即可。點擊Slop,停止預掃描。4）、若背景噪音仍過多也可選上Filter Mod, KdlllMII來降低隨機噪音干擾（次數越多降噪越好，但掃描時間也越長，一般在HV較

8、高時使用）。5）、點擊K尸進行取圖，保存及相關圖像處理。（注意：原始圖像一定要保存為oib格式）FillerMode6）、去掉心加卜血，將掃描速度、size恢復至初始狀態(tài)（掃描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel,size為512by）,為下一個標本做好取圖準備。四、刻錄數據圖像保存后，退出FV10-ASW軟件，刻錄數據（注意：必須用新的光盤，嚴禁使用U盤、移到硬盤等）五、關機務必先關鑰匙后關電源！1、關閉熒光汞燈（注意：開啟后，“15分鐘內勿關”）2、關閉激光器1）、關閉LD559激光器2）、關閉MCPSU半導體綜合激光器3）、氮離子多線激光器（注意：先關鑰匙，千萬別馬上關閉電源，要等風扇停止轉動后再關閉電源）3、使用擦鏡紙沾擦顯微鏡物鏡（注意：一般物鏡清洗液為乙醇，擦鏡紙為普通擦鏡